Explicarea termenilor de bază de biologie moleculară
1. ADNc și ADNcc: ADNc este un ADN dublu catenar sintetizat prin transcriptază inversă din ARNm;cccDNA este un ADN circular închis, dublu catenar, lipsit de cromozom.
2. Unitate de pliere standard: unitatea de structură secundară a proteinei α-helix și β-sheet pot forma blocuri structurale cu aranjamente geometrice speciale prin diferite polipeptide de legătură.Acest tip de pliere determinată se numește de obicei superstructură secundară.Aproape toate structurile terțiare pot fi descrise de aceste tipuri de pliere și chiar de tipurile lor combinate, deci sunt numite și unități de pliere standard.
3. CAP: proteina receptorului de adenozin monofosfat ciclic (cAMP) CRP (proteina receptorului cAMP), complexul format în urma combinației dintre cAMP și CRP se numește activating protein CAP (cAMP activated protein)
4. Secvență palindromică: Secvența complementară inversă a unui segment al unui fragment de ADN, adesea un situs al enzimei de restricție.
5. ARNmc: ARN interferent complementar sau ARN antisens, care este complementar secvenței ARNm și poate inhiba translația ARNm.
6. Ribozimă: ARN cu activitate catalitică, care joacă un rol autocatalitic în procesul de splicing al ARN.
7. Motiv: Există unele regiuni locale cu formă tridimensională și topologie similare în structura spațială a moleculelor de proteine
8. Peptidă semnal: o peptidă cu 15-36 reziduuri de aminoacizi la capătul N-terminal în timpul sintezei proteinei, care ghidează transmembrana proteinei.
9. Atenuator: O secvență de nucleotide între o regiune operator și o genă structurală care termină transcripția.
10. Magic Spot: Când bacteria crește și se confruntă cu o lipsă completă de aminoacizi, bacteriile vor produce un răspuns de urgență pentru a opri expresia tuturor genelor.Semnalele care generează acest răspuns de urgență sunt guanozin tetrafosfat (ppGpp) și guanozin pentafosfat (pppGpp).Rolul PpGpp și pppGpp nu este doar unul sau câțiva operoni, ci afectează un număr mare dintre aceștia, așa că sunt numiți super-regulatori sau puncte magice.
11. Element promotor în amonte: se referă la secvența de ADN care joacă un rol reglator în activitatea promotorului, cum ar fi TATA în regiunea -10, TGACA în regiunea -35, amplificatori și atenuatori.
12. Sondă de ADN: un segment marcat de ADN cu o secvență cunoscută, care este utilizat pe scară largă pentru a detecta secvențe necunoscute și pentru a verifica genele țintă.
13. Secvența SD: Este secvența de legare a ribozomului și ARNm, care reglează translația.
14. Anticorp monoclonal: un anticorp care acționează numai împotriva unui singur determinant antigenic.
15. Cosmid: Este un vector ADN exogen construit artificial care reține regiunile COS la ambele capete ale fagului și este conectat la plasmidă.
16. Screening pete albastre-albe: gena LacZ (codifică β-galactozidaza), enzima poate descompune substratul cromogen X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactozida) pentru a produce albastru, făcând astfel tulpina albastră.Când ADN-ul exogen este inserat, gena LacZ nu poate fi exprimată, iar tulpina este albă, astfel încât să se filtreze bacteriile recombinante.Aceasta se numește screening albastru-alb.
17. Element cu acțiune cis: O secvență specifică de baze din ADN care reglează expresia genelor.
18. Enzima Klenow: Fragment mare de ADN polimerază I, cu excepția faptului că activitatea exonucleazei 5’ 3’ este îndepărtată din holoenzima ADN polimerazei I
19. PCR ancorat: folosit pentru a amplifica ADN-ul de interes cu o secvență cunoscută la un capăt.O coadă poli-dG a fost adăugată la un capăt al secvenței necunoscute și apoi poli-dC și secvența cunoscută au fost utilizate ca primeri pentru amplificarea PCR.
20. Proteina de fuziune: Gena proteinei eucariote este conectată cu gena exogenă, iar proteina compusă din translația proteinei genei originale și a proteinei exogene este exprimată în același timp.
Alți termeni de biologie moleculară
1. Harta fizică a ADN-ului este ordinea în care sunt aranjate fragmentele (digerate cu endonuclează de restricție) ale moleculei de ADN.
2. Scindarea RNazei este împărțită în două tipuri (autocataliza) și (heterocataliza).
3. Există trei factori de inițiere la procariote sunt (IF-1), (IF-2) și (IF-3).
4. Proteinele transmembranare necesită ghidare (peptide semnal), iar rolul chaperonelor proteice este (ajută la plierea lanțului peptidic în conformația nativă a proteinei).
5. Elementele din promotori pot fi, în general, împărțite în două tipuri: (elemente promotoare de bază) și (elemente promotoare din amonte).
6. Conținutul cercetării biologiei moleculare include în principal trei părți: (biologia moleculară structurală), (expresia și reglarea genelor) și (tehnologia recombinarii ADN).
7. Cele două experimente cheie care demonstrează că ADN-ul este materialul genetic sunt (infecția cu pneumococ a șoarecilor) și (infecția cu fagii T2 cu Escherichia coli).potenţial).
8. Există două diferențe principale între ARNm și ARNm: (ARNmn este îmbinat în procesul de conversie în ARNm), (capătul 5’ al ARNm este adăugat cu un capac m7pGppp și există o poliadenilare suplimentară la capătul 3’ al cozii acidului ARNm (poliA)).
9. Avantajele formei de proteine cu mai multe subunități sunt (subunitatea este o metodă economică pentru utilizarea ADN-ului), (poate reduce impactul erorilor aleatoare în sinteza proteinelor asupra activității proteinelor), (activitatea poate fi foarte eficient și rapid sunt deschise și închise).
10. Conținutul principal al teoriei de nucleare a mecanismului de pliere a proteinei include (nucleare), (îmbogățire structurală), (rearanjare finală).
11. Galactoza are un dublu efect asupra bacteriilor;pe de o parte (poate fi folosit ca sursă de carbon pentru creșterea celulelor);pe de altă parte (este și o componentă a peretelui celular).Prin urmare, un promotor S2 independent de AMPc-CRP este necesar pentru sinteza permanentă la nivel de fundal;în același timp, este necesar un promotor S1 dependent de cAMP-CRP pentru a regla sinteza de nivel înalt.Transcrierea începe de la (S2) cu G și de la (S1) fără G.
12. Tehnologia ADN-ului recombinant este cunoscută și sub denumirea de (donare genică) sau (clonare moleculară).Scopul final este (de a transfera informațiile genetice ADN dintr-un organism într-un alt organism).Un experiment tipic de recombinare ADN include de obicei următorii pași: (1) Extrageți gena țintă (sau gena exogenă) a organismului donor și conectați-o enzimatic la o altă moleculă de ADN (vector de clonare) pentru a forma o nouă moleculă de ADN recombinant.② Molecula de ADN recombinat este transferată în celula primitoare și replicată în celula primitoare.Acest proces se numește transformare.③ Selectați și identificați acele celule primitoare care au absorbit ADN-ul recombinat.④Cultivați celulele care conțin ADN recombinat în cantități mari pentru a detecta dacă gena ajutorului străin este exprimată.
13. Există două tipuri de replicare a plasmidelor: cele care sunt strict controlate de sinteza proteinelor celulei gazdă se numesc (plasmide strânse), iar cele care nu sunt strict controlate de sinteza proteinei celulei gazdă se numesc (plasmide relaxate).
14. Sistemul de reacție PCR trebuie să aibă următoarele condiții: a.Primeri ADN (aproximativ 20 de baze) cu secvențe complementare la fiecare capăt al celor două catene ale genei țintă care urmează să fie separate.b.Enzime cu stabilitate termică precum: TagDNA polimeraza.c, dNTPd, secvență de ADN de interes ca șablon
15. Procesul de reacție de bază al PCR include trei etape: (denaturare), (recoacere) și (extindere).
16. Procesul de bază al animalelor transgenice include de obicei: ①Introducerea genei străine clonate în nucleul unui ou fertilizat sau al unei celule stem embrionare;②Transplantul de ovul fertilizat inoculat sau de celule stem embrionare în uterul feminin;③Dezvoltare și creștere embrionară completă pentru urmași cu gene străine;④ Folosiți aceste animale care pot produce proteine străine ca animale de reproducție pentru a reproduce noi linii homozigote.
17. Liniile celulare de hibridom sunt generate prin hibridizarea celulelor (splină B) cu celule (mielom) și, deoarece (celulele splinei) pot utiliza hipoxantina și (celulele osoase) asigură funcții de diviziune celulară, acestea pot fi crescute în mediu HAT.crește.
18. Odată cu aprofundarea cercetării, prima generație de anticorpi se numește (anticorpi policlonali), a doua generație (anticorpi monoclonali) și a treia generație (anticorpi de inginerie genetică).
19. În prezent, ingineria genetică a virusurilor insectelor se concentrează în principal pe baculovirus, care se manifestă prin introducerea (genei toxinei exogene);(gene care perturbă ciclul normal de viață al insectelor);(modificarea genelor virusului).
20. Factorii proteici cu acţiune trans corespunzând elementelor comune TATA, GC şi CAAT din promotorul ARN polimerazei II de mamifer sunt (TFIID), (SP-1) şi respectiv (CTF/NF1).
douăzeci și unu.Factorii de transcripție de bază ai ARN polimerazei Ⅱ sunt TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, iar secvența lor de legare este: (D, A, B, E).În care funcția TFII-D este (se leagă la caseta TATA).
douăzeci și doi.Majoritatea factorilor de transcripție care se leagă de ADN funcționează sub formă de dimeri.Domeniile funcționale ale factorilor de transcripție care se leagă de ADN sunt în mod obișnuit următoarele (helix-turn-helix), (motiv deget de zinc), motiv de fermoar (bazic-leucină).
douăzeci și trei.Există trei tipuri de moduri de scindare a endonucleazei de restricție: (tăiat pe partea de 5' a axei de simetrie pentru a genera capete lipicioase 5'), (tăiată pe partea de 3' a axei de simetrie pentru a genera capete lipicioase de 3' (tăiată la axa de simetrie pentru a genera segmente plate)).
douăzecișipatru.ADN-ul plasmid are trei configurații diferite: (configurație SC), (configurație oc), (configurație L).Primul în electroforeză este (configurația SC).
25. Sisteme de expresie a genelor exogene, în principal (Escherichia coli), (Drojdie), (Insecte) și (Tabelul cu celule de mamifere).
26. Metodele utilizate în mod obișnuit pentru animalele transgenice sunt: (metoda infecției retrovirale), (metoda microinjecției ADN), (metoda celulelor stem embrionare).
Aplicație Biologie moleculară
1. Numiți funcțiile a mai mult de 5 ARN-uri?
ARNt de transfer Aminoacid de transfer Ribozom ARN ARNr Ribozomul constituie ARN mesager ARNm Sinteză de proteine ARNn nuclear heterogen Precursor al ARNmnului matur ARNn nuclear mic Implicat în splicingul ARNn ARNn citoplasmatic mic ARN scRNA/7SL-ARN proteină Componente plasmatice ARNm sinteză Componente ARNm și ARNm localizat Componente anti-ARN-ensă și ARNm localizate expresie ARN ribozimă ARN activ enzimatic
2. Care este principala diferență dintre promotorii procarioți și eucarioți?
TTGACA procariotă --- TATAAT------Locul de inițiere-35 -10 Amplificator eucariotic---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Situat de inițiere-110 -70 -25
3. Care sunt principalele aspecte ale construcției artificiale a plasmidelor naturale?
Plasmidele naturale au adesea defecte, deci nu sunt potrivite pentru utilizare ca purtători pentru inginerie genetică și trebuie modificate și construite: a.Adăugați gene marker de selecție adecvate, cum ar fi două sau mai multe, care sunt ușor de utilizat pentru selecție, de obicei gene antibiotice.b.Creșteți sau micșorați locurile adecvate de tăiere a enzimelor pentru a facilita recombinarea.c.Scurtați lungimea, tăiați fragmentele inutile, îmbunătățiți eficiența importului și creșteți capacitatea de încărcare.d.Schimbați repliconul, de la strâns la liber, de la mai puține copii la mai multe copii.e.Adăugați elemente genetice speciale conform cerințelor speciale ale ingineriei genetice
4. Dați un exemplu de metodă pentru screening-ul diferențial al ADNc-ului specific țesuturilor?
Două populații de celule sunt pregătite, gena țintă este exprimată sau puternic exprimată într-una dintre celule, iar gena țintă nu este exprimată sau slab exprimată în cealaltă celulă și apoi gena țintă este găsită prin hibridizare și comparare.De exemplu, în timpul apariției și dezvoltării tumorilor, celulele tumorale vor prezenta ARNm cu niveluri de expresie diferite decât celulele normale.Prin urmare, genele legate de tumoră pot fi eliminate prin hibridizare diferențială.Metoda de inducție poate fi utilizată și pentru a elimina genele a căror expresie este indusă.
5. Generarea și screening-ul liniilor celulare de hibridom?
Celulele B splinei + celule de mielom, se adaugă polietilen glicol (PEG) pentru a promova fuziunea celulară, iar celulele de fuziune a mielomului B splenic crescute în mediu HAT (conținând hipoxantină, aminopterina, T) continuă să se extindă hrănesc.Fuziunea celulară conține: celule de fuziune splină-splină: incapabile să crească, celulele splinei nu pot fi cultivate in vitro.Celulele de fuziune os-os: nu pot utiliza hipoxantina, dar pot sintetiza purina prin a doua cale folosind folat reductază.Aminopterina inhibă folat reductaza și, prin urmare, nu poate crește.Celulele de fuziune os-splină: pot crește în HAT, celulele splinei pot utiliza hipoxantina, iar celulele osoase asigură funcția de diviziune celulară.
6. Care este principiul și metoda de determinare a structurii primare a ADN-ului prin metoda terminației dideoxi terminale (metoda Sanger)?
Principiul este de a folosi un terminator al lanțului nucleotidic - 2,,3,-dideoxinucleotidă pentru a termina extensia ADN-ului.Deoarece îi lipsește 3-OH necesar pentru formarea legăturilor 3/5/fosfodiester, odată încorporat în lanțul de ADN, lanțul de ADN nu poate fi extins în continuare.Conform principiului împerecherii bazelor, ori de câte ori ADN polimeraza are nevoie de dNMP pentru a participa în lanțul de ADN extins în mod normal, există două posibilități, una este de a participa la ddNTP, care are ca rezultat terminarea extinderii lanțului deoxinucleotid;celălalt este de a participa la dNTP, astfel încât lanțul ADN să poată continua să se extindă până când următorul ddNTP este încorporat.Conform acestei metode, se poate obține un grup de fragmente de ADN de lungimi diferite care se termină în ddNTP.Metoda este de a împărți în patru grupuri, respectiv ddAMP, ddGMP, ddCMP și ddTMP.După reacție, electroforeza pe gel de poliacrilamidă poate citi secvența ADN în funcție de benzile de înot.
7. Care este efectul de reglare pozitivă al proteinei activatoare (CAP) asupra transcripției?
Proteina receptorului adenilat ciclic (cAMP) CRP (proteina receptorului cAMP), complexul format din combinația dintre cAMP și CRP se numește CAP (proteina activată cu cAMP).Când E. coli este crescută într-un mediu lipsit de glucoză, sinteza CAP crește, iar CAP are funcția de a activa promotori precum lactoza (Lac).Unii promotori dependenți de CRP le lipsește caracteristica tipică a secvenței regiunii -35 (TTGACA) pe care o au promotorii comuni.Prin urmare, este dificil ca ARN polimeraza să se lege de ea.Prezența CAP (funcție): poate îmbunătăți semnificativ constanta de legare a enzimei și a promotorului.Prezintă în principal următoarele două aspecte: ① CAP ajută molecula de enzimă să se orienteze corect prin modificarea conformației promotorului și a interacțiunii cu enzima, astfel încât să se combine cu regiunea -10 și să joace rolul de a înlocui funcția regiunii -35.②CAP poate inhiba, de asemenea, legarea ARN polimerazei de alte situsuri din ADN, crescând astfel probabilitatea de a se lega de promotorul său specific.
8. Ce pași sunt de obicei incluși într-un experiment tipic de recombinare a ADN-ului?
A.Extrageți gena țintă (sau gena exogenă) a organismului donor și conectați-o enzimatic la o altă moleculă de ADN (vector de clonare) pentru a forma o nouă moleculă de ADN recombinant.b.Transferați molecula de ADN recombinat în celula primitoare și replicați-o și păstrați-o în celula primitoare.Acest proces se numește transformare.c.Selectați și identificați acele celule primitoare care au absorbit ADN-ul recombinant.d.Cultură în masă a celulelor care conțin ADN-ul recombinant pentru a detecta dacă gena de ajutor străină este exprimată.
9. Construirea bibliotecii de gene Sunt prezentate trei metode de screening a recombinantelor, iar procesul este descris pe scurt.
Screeningul rezistenței la antibiotice, inactivarea inserțională a rezistenței, screening-ul pete alb-albastre sau screening PCR, screening diferențial, sondă ADN Majoritatea vectorilor de clonare poartă gene de rezistență la antibiotice (anti-ampicilină, tetraciclină).Când plasmida este transferată în Escherichia coli, bacteriile vor dobândi rezistență, iar cele fără transfer nu vor avea rezistență.Dar nu poate distinge dacă a fost reorganizat sau nu.Într-un vector care conține două gene de rezistență, dacă un fragment de ADN străin este inserat într-una dintre gene și face ca gena să fie inactivată, pot fi utilizate două controale pe placă care conțin diferite medicamente pentru a detecta recombinanți pozitivi.De exemplu, plasmida pUC conține gena LacZ (codifică β-galactozidaza), care poate descompune substratul cromogen X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactozida) pentru a produce albastru, transformând astfel tulpina în albastru.Când ADN-ul străin este inserat, gena LacZ nu poate fi exprimată, iar tulpina este albă, astfel încât să se filtreze bacteriile recombinante.
10. Explicați procesul de bază al obținerii animalelor transgenice prin intermediul celulelor stem embrionare?
Celulele stem embrionare (ES) sunt celule embrionare în timpul dezvoltării embrionare, care pot fi cultivate și proliferate artificial și au funcția de diferențiere în alte tipuri de celule.Cultura celulelor ES: masa celulară interioară a blastocistului este izolată și cultivată.Când ES este cultivat într-un strat fără hrănitor, se va diferenția în diferite celule funcționale, cum ar fi celulele musculare și celulele N.Când este cultivat într-un mediu care conține fibroblaste, ES va menține funcția de diferențiere.ES poate fi manipulat genetic, iar funcția sa de diferențiere poate fi integrată fără a-i afecta funcția de diferențiere, ceea ce rezolvă problema integrării aleatorii.Introduceți gene exogene în celulele stem embrionare, apoi implantați în uterul șoarecilor femele gravide, dezvoltați în pui și încrucișați pentru a obține șoareci homozigoți.
