În stadiul incipient al focarului, datorită dezvoltării rapide, diagnosticarea rapidă a pacienților suspectați este cheia prevenirii COVID-19.Unii reactivi de detectare a acidului nucleic aprobați au un timp de dezvoltare scurt și există probleme precum confirmarea grăbită a performanței, optimizarea insuficientă a reactivului și diferențe mari între loturi;Problemele diferitelor laboratoare clinice în diferite aspecte ale procesului de detectare a acidului nucleic pot afecta, de asemenea, acuratețea rezultatelor de detectare a acidului nucleic.Acest articol se va concentra pe legăturile și punctele cheie în detectarea actuală a acidului nucleic SARS-CoV-2 și va analiza problemele reexaminării fals negative și pozitive a detectării acidului nucleic de laborator și inconsistența clinică.

Principiile detectării acidului nucleic SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 este un virus ARN cu o secvență de genom de aproximativ 29 kb, cu 10 gene, care poate codifica eficient 10 proteine.Virușii sunt formați din ARN și proteine, iar stratul cel mai exterior este un înveliș exterior compus din lipide și glicoproteine.În interior, capsida proteinei învelește ARN-ul în ea, protejând astfel ARN-ul ușor degradabil (P1).

P1 Structura SARS-COV-2

Virușii invadează celulele prin receptori specifici de suprafață celulară pentru a provoca infecție și folosesc celulele gazdă pentru a se replica.

Principiul detectării acidului nucleic viral este de a expune ARN-ul viral printr-un lizat de celule și apoi de a folosi fluorescentă în timp real cu transcripție inversă-reacție în lanț a polimerazei (RT-PCR) pentru detectare.

Cheia principiului de detectare este utilizarea primerilor și a sondelor pentru a obține „potrivirea țintită” a secvențelor de acid nucleic, adică pentru a găsi secvența de acid nucleic a SARS-CoV-2 care este diferită de alte viruși în aproximativ 30.000 de baze (asemănarea acidului nucleic cu alți viruși) zona „scăzută”), proiectați primeri și sonde.

Primerii și sondele sunt foarte potrivite cu regiunea specifică a acidului nucleic SARS-CoV-2, adică specificitatea este foarte puternică.Odată ce rezultatul amplificării RT-PCR fluorescentă în timp real a probei de testat este pozitiv, se demonstrează că SARS-CoV-2 este prezent în probă.Vezi P2.

P2 Etapele determinării acidului nucleic SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescent în timp real)

Condiții și cerințe de laborator pentru detectarea acidului nucleic SARS-CoV-2

Laboratoarele de testare a acidului nucleic sunt cele mai ideale pentru mediile cu presiune negativă și ar trebui să acorde atenție monitorizării presiunii, să mențină fluxul de aer și să elimine aerosolii.Personalul de testare a acidului nucleic trebuie să aibă calificările corespunzătoare, să primească o formare relevantă privind reacția în lanț a polimerazei și să treacă evaluarea.Laboratorul ar trebui să fie strict administrat, zonat în loc, iar personalului irelevant este strict interzis să intre.Zona curată trebuie să fie ventilată și dezinfectată pe loc.Articolele relevante sunt plasate în zone, curate și murdare sunt separate, înlocuite la timp și decontaminate la loc.Dezinfectarea de rutină: Dezinfectantul care conține clor este soluția principală pentru suprafețe mai mari, iar alcoolul 75% poate fi folosit pentru suprafețe mici.O modalitate bună de a face față aerosolilor este deschiderea ferestrelor pentru ventilație, iar dezinfecția aerului poate fi efectuată și prin intermediul razelor ultraviolete, filtrare și dezinfectare a aerului.

Legături cheie și parametri ai determinării acidului nucleic SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescent în timp real)

Deși laboratoarele acordă în general o atenție deosebită „detecției” acidului nucleic, de fapt, „extracția” acidului nucleic este, de asemenea, unul dintre pașii cheie pentru detectarea cu succes, care este strâns legată de colectarea și stocarea probelor de virus.

În prezent, cele mai utilizate probe respiratorii, cum ar fi tampoanele nazofaringiene, folosesc a doua metodă, care este o soluție de inactivare (conservare) preparată pe baza de extracție a acidului nucleic și soluție de liză.Pe de o parte, această soluție de conservare a virusului poate denatura proteina virusului, își poate pierde activitatea și nu mai fi infecțioasă și poate îmbunătăți siguranța etapei de transport și detecție;pe de altă parte, poate sparge direct virusul pentru a elibera acidul nucleic, a elimina enzima de descompunere a acidului nucleic și a preveni virusul.ARN-ul este degradat.

O soluție de prelevare de probe de virus preparată pe baza unei soluții de liză de extracție a acidului nucleic.Componentele principale sunt săruri echilibrate, agent de chelare a acidului etilendiaminotetraacetic, sare de guanidină (izotiocianat de guanidină, clorhidrat de guanidină, etc.), surfactant anionic (dodecan) sulfat de sodiu), agent tensioactiv cationic (oxalat de tetradecil trimetil amoniu), fenol, proteină, 8-hidrotixitol, mai multe componente, K-8-hidrotixitol, sau mai multe componente.În prezent, există multe tipuri de truse de extracție a acidului nucleic și sunt utilizați diferiți reactivi de extracție și purificare a acidului nucleic.Chiar dacă se utilizează același reactiv de extracție și purificare a acidului nucleic, procedurile de extracție ale fiecărui kit sunt diferite.

În prezent, kiturile de detectare a acidului nucleic aprobate de Administrația Națională a Produselor Medicale sunt selectate pe baza genelor ORF1ab, E și N din genomul SARS-CoV-2.Principiile de detectare a diferitelor produse sunt practic aceleași, dar amorsele lor și designul sondelor sunt diferite.Există segmente cu o singură țintă (ORF1ab), segmente cu țintă dublă (ORF1ab, N sau E) și segmente cu trei țintă (ORF1ab, N și E).Diferența dintre detectare și interpretare, extracția acidului nucleic și sistemul de reacție RT-PCR fluorescent în timp real ar trebui să se refere la instrucțiunile relevante ale kit-ului și se recomandă ca utilizatorii să urmeze cu strictețe metoda de interpretare specificată în instrucțiunile kit pentru interpretare.Regiunile comune, primerii și secvențele de sondă amplificate prin RT-PCR fluorescentă în timp real sunt prezentate în P3.

P3 Locația țintei ampliconului SARS-CoV-2 pe genom și secvența primerilor și a sondelor

Interpretarea rezultatelor determinării acidului nucleic SARS-CoV-2 (Real-Time fluorescent RT-PCR)

„Planul de prevenire și control al pneumoniei pentru infecția cu SARS-CoV-2 (ediția a doua)” a clarificat pentru prima dată criteriile de evaluare a rezultatelor amplificării unei singure gene:

1. Nici un Ct sau Ct≥40 nu este negativ;

2. Ct<37 este pozitiv;

3. Valoarea Ct de 37-40 este zona pe scară de gri.Se recomandă repetarea experimentului.Dacă rezultatul refacerii Ct<40 și curba de amplificare are vârfuri evidente, eșantionul este considerat pozitiv, în caz contrar este negativ.”

A treia ediție a ghidului și a patra ediție a ghidului au continuat criteriile de mai sus.Cu toate acestea, din cauza diferitelor ținte utilizate în trusele comerciale, ediția a 3-a menționată mai sus a ghidului nu a oferit criteriile pentru determinarea combinației de ținte, subliniind instrucțiunile furnizate de producător vor prevala.Începând cu cea de-a cincea ediție a ghidurilor, au fost clarificate două ținte, în special criteriile de judecată pentru o singură țintă greu de judecat.Adică, dacă laboratorul dorește să confirme că un caz este pozitiv pentru detectarea acidului nucleic SARS-CoV-2, trebuie îndeplinite următoarele 1 din 2 condiții:

(1) Două ținte ale SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) din aceeași probă sunt testate pozitiv prin RT-PCR fluorescent în timp real.Dacă o singură țintă este pozitivă, sunt necesare reeșantionarea și re-testarea.Dacă rezultatele testului sunt Dacă ținta unică este încă pozitivă, este considerată pozitivă.

(2) Două probe de RT-PCR fluorescentă în timp real au arătat o singură țintă pozitivă în același timp sau două probe de același tip au prezentat un singur rezultat pozitiv al testului țintă, care poate fi considerat pozitiv.Cu toate acestea, liniile directoare subliniază, de asemenea, că rezultatele negative ale testării acidului nucleic nu pot exclude infecția cu SARS-CoV-2.Factorii care pot provoca fals negative trebuie excluși, inclusiv calitatea proastă a probei (probe respiratorii din orofaringe și alte părți), colectarea probelor prea devreme sau prea târziu, Probele nu au fost stocate, transportate și procesate corect, iar tehnologia în sine a avut probleme (variația virusului, inhibarea PCR) etc.

Cauzele fals negative în detectarea SARS-CoV-2

Conceptul de „fals negativ” în testarea acidului nucleic care este preocupat în prezent, se referă adesea la „fals negativi” în care rezultatele testelor de acid nucleic sunt inconsistente cu manifestările clinice, adică simptomele clinice și rezultatele imagistice sunt foarte suspectate de COVID-19, dar testele de acid nucleic sunt întotdeauna „negative” de multe ori.Centrul de Laborator Clinic al Comisiei Naționale de Sănătate a explicat testul SARS-CoV-2 „fals negativ”.

(1) Există o anumită cantitate de virus în celulele persoanei infectate.Datele existente arată că, după ce organismul este infectat cu virus, virusul intră în gât prin nas și gură, apoi în trahee și bronhii, iar apoi ajunge la alveole.Persoana infectată va experimenta perioada de incubație, simptome ușoare și apoi procesul de simptome severe și diferite stadii ale bolii.Și cantitatea de virus prezentă în diferite părți ale corpului este diferită.

În ceea ce privește încărcătura virală a tipurilor de celule, celulele epiteliale alveolare (tractul respirator inferior)> celulele epiteliale ale căilor respiratorii (tractul respirator superior)> fibroblastele, celulele endoteliale și macrofagele etc.;din tipul probei, lichid de lavaj alveolar (cel mai Excelent)>sputa tuse profunda>tamp nazofaringian>tampon orofaringian>sânge.În plus, virusul poate fi detectat și în fecale.Cu toate acestea, având în vedere comoditatea operației și acceptarea pacienților, ordinea de eșantion clinică folosită în mod obișnuit este tamponul orofaringian>tampon nazofaringian>lichid de lavaj bronșic (operație complexă) și spută profundă (de obicei tuse uscată, dificil de obținut).

Prin urmare, cantitatea de virus din celulele orofaringelui sau nazofaringelui unor pacienți este mică sau extrem de mică.Dacă se prelevează doar probe de orofaringe sau nazofaringe pentru testare, acidul nucleic viral nu va fi detectat.

(2) Nu au fost colectate celule care conțin virusuri în timpul colectării probei sau acidul nucleic viral nu a fost conservat în mod eficient.

[① Loc de colectare necorespunzător, de exemplu, la colectarea tampoane orofaringiene, adâncimea de colectare nu este suficientă, tampoanele nazofaringiene colectate nu sunt colectate adânc în cavitatea nazală etc. Majoritatea celulelor colectate pot fi celule fără virus;

②Tampoanele de prelevare sunt utilizate incorect.De exemplu, fibrele sintetice precum fibra PE, fibra de poliester și fibra de polipropilenă sunt recomandate pentru materialul capului tamponului.Fibrele naturale, cum ar fi bumbacul, sunt utilizate în funcționarea efectivă (adsorbție puternică de proteine ​​și nu este ușor de spălat) și fibre de nailon (absorbție slabă a apei, ceea ce duce la un volum insuficient de prelevare);

③Utilizarea incorectă a tuburilor de stocare a virusului, cum ar fi utilizarea greșită a tuburilor de depozitare din plastic din polipropilenă sau polietilenă, care sunt ușor de absorbit acizii nucleici (ADN/ARN), ducând la o scădere a concentrației de acid nucleic în soluția de depozitare.În practică, se recomandă utilizarea plasticului polimer de polietilenă-propilenă și a unor recipiente din plastic din polipropilenă tratate special pentru depozitarea acizilor nucleici virali.]

[① Loc de colectare necorespunzător, de exemplu, la colectarea tampoane orofaringiene, adâncimea de colectare nu este suficientă, tampoanele nazofaringiene colectate nu sunt colectate adânc în cavitatea nazală etc. Majoritatea celulelor colectate pot fi celule fără virus;

②Tampoanele de prelevare sunt utilizate incorect.De exemplu, fibrele sintetice precum fibra PE, fibra de poliester și fibra de polipropilenă sunt recomandate pentru materialul capului tamponului.Fibrele naturale, cum ar fi bumbacul, sunt utilizate în funcționarea efectivă (adsorbție puternică de proteine ​​și nu este ușor de spălat) și fibre de nailon (absorbție slabă a apei, ceea ce duce la un volum insuficient de prelevare);

③Utilizarea incorectă a tuburilor de stocare a virusului, cum ar fi utilizarea greșită a tuburilor de depozitare din plastic din polipropilenă sau polietilenă, care sunt ușor de absorbit acizii nucleici (ADN/ARN), ducând la o scădere a concentrației de acid nucleic în soluția de depozitare.În practică, se recomandă utilizarea plasticului polimer de polietilenă-propilenă și a unor recipiente din plastic din polipropilenă tratate special pentru depozitarea acizilor nucleici virali.]

(4) Funcţionarea laboratorului clinic nu este standardizată.Condițiile de transport și depozitare a probelor, funcționarea standardizată a laboratoarelor clinice, interpretarea rezultatelor și controlul calității sunt factorii cheie pentru a asigura acuratețea și fiabilitatea rezultatelor testelor.Conform rezultatelor evaluării externe a calității efectuate de Centrul de Laborator Clinic al Comisiei Naționale de Sănătate în perioada 16-24 martie 2020, din cele 844 de laboratoare care au primit rezultate valide, 701 (83,1%) au fost calificate, iar 143 (16,9%) nu au fost.Calificat, condițiile generale de testare în laborator sunt bune, dar diferite laboratoare au încă diferențe în capacitatea de operare a personalului, capacitatea de interpretare a probelor pozitive cu o singură țintă și controlul calității.

Cum se reduce falsul negativ al detectării acidului nucleic SARS-CoV-2?

Reducerea negativelor false în detectarea acidului nucleic ar trebui optimizată din cele patru aspecte ale producerii de negative false.

(1) Există o anumită cantitate de virus în celulele persoanei infectate.Concentrația virusului în diferite părți ale corpului persoanelor suspectate infectate va fi diferită în momente diferite.Dacă nu există faringe, acesta poate fi în lichidul de lavaj bronșic sau în fecale.Dacă mai multe tipuri de probe pot fi colectate în același timp sau în diferite stadii de progresie a bolii pentru testare, va ajuta la evitarea fals negative.

(2) Celulele care conțin virus ar trebui colectate în timpul colectării probei.Această problemă poate fi rezolvată în mare măsură prin consolidarea pregătirii colectorilor de probe.

(3) Reactivi IVD fiabili.Efectuând cercetări privind evaluarea performanței de detecție a reactivilor la nivel național și discutând problemele existente, eficiența de detecție a reactivilor poate fi îmbunătățită în continuare și sensibilitatea analizei poate fi îmbunătățită.

(4) Funcționarea standardizată a laboratoarelor clinice.Prin consolidarea pregătirii personalului de laborator, îmbunătățirea continuă a sistemului de management al calității laboratorului, asigurarea unor diviziuni rezonabile și îmbunătățirea capacității personalului de a detecta, este posibilă reducerea falselor negative din cauza operațiunilor necorespunzătoare ale laboratorului.

Motive pentru retestarea pozitivă a testului de acid nucleic SARS-CoV-2 la pacienții recuperați și externați

„Planul de diagnostic și tratament COVID-19 (Trial Seventh Edition)” stipulează în mod clar că unul dintre criteriile pentru ca pacienții cu COVID-19 să fie vindecați și externați din spital este ca două probe consecutive de tract respirator să aibă un test de acid nucleic negativ (la cel puțin 24 de ore distanță), dar sunt foarte puțini pacienții cu SARS-CoV-2 a fost din nou pozitiv din cauza testului de acid nucleic din diferite motive.

(1) SARS-CoV-2 este un virus nou.Este necesar să înțelegem în continuare mecanismul său patogen, imaginea completă a bolii cauzate și caracteristicile evoluției bolii.Prin urmare, pe de o parte, este necesar să se întărească managementul pacienților externați și să se efectueze observație medicală de 14 zile.Efectuați urmărirea, monitorizarea sănătății și îndrumarea sănătății pentru a aprofunda înțelegerea întregului proces de apariție, dezvoltare și rezultat al bolii.

(2) Pacientul poate fi infectat din nou cu virusul.Academicianul Zhong Nanshan a spus: Deoarece pacienții vindecați au anticorpi, SARS-CoV-2 poate fi eliminat de anticorpi atunci când invadează din nou.Există multe motive, care pot fi cauza pacientului recuperat, sau pot fi legate de mutația virusului, sau chiar cauza testelor de laborator.Dacă este virusul însuși, mutația SARS-CoV-2 poate face ca anticorpul produs de pacientul recuperat să fie ineficient împotriva virusului mutant.Dacă pacientul este infectat din nou cu virusul mutant, testul acidului nucleic poate fi din nou pozitiv.

(3) În ceea ce privește metodele de testare de laborator, fiecare metodă de testare are limitările sale.Detectarea acidului nucleic SARS-CoV-2 se datorează alegerii secvenței genelor, compoziției reactivilor, sensibilității metodei și altor motive, ceea ce duce la ca kiturile existente să aibă propriile limite inferioare de detecție.După ce pacientul este tratat, virusul din organism scade.Când încărcătura virală din proba de testat este sub limita inferioară de detectare, va apărea un rezultat „negativ”.Cu toate acestea, acest rezultat nu înseamnă că virusul din organism a dispărut complet.Virusul poate apărea după oprirea tratamentului.Resurgență”, continuă să copiezi.Prin urmare, se recomandă revizuirea o dată pe săptămână în decurs de 2 până la 4 săptămâni după externare.

(4) Acidul nucleic este materialul genetic al virusului.Virusul este ucis după ce pacientul a fost supus unui tratament antiviral, dar fragmentele rămase de ARN viral sunt încă reținute în corpul uman și nu sunt complet evacuate din organism.Uneori, în anumite circumstanțe, poate fi mai păstrat.Mult timp, iar în acest moment testul de acid nucleic va fi pozitiv „tranzitoriu”.Odată cu prelungirea timpului de recuperare al pacientului, după ce fragmentele de ARN reziduale din organism sunt epuizate treptat, rezultatul testului de acid nucleic poate deveni negativ.

(5) Rezultatul testului de acid nucleic al SARS-CoV-2 dovedește doar prezența sau absența ARN viral și nu poate dovedi activitatea virusului și dacă virusul este transmisibil.Este necesar să se demonstreze dacă un pacient care are din nou un test de acid nucleic pozitiv va deveni din nou o sursă de infecție.Este necesar să se efectueze cultura de virus pe probe clinice și să se cultive un virus „viu” pentru a dovedi că este infecțios.

rezumat

În rezumat, testele de acid nucleic SARS-CoV-2 fals negative, retest pozitive și alte afecțiuni care sunt incompatibile cu manifestările clinice nu pot fi evitate complet.În screening-ul și testarea efectivă, se recomandă combinarea simptomelor clinice, a examinărilor imagistice (CT) și a experimentelor Rezultatele testelor de laborator (test de acid nucleic + test de anticorpi specifici virusului) pentru un diagnostic cuprinzător pentru a preveni diagnosticarea greșită și diagnosticarea greșită.În cazul în care rezultatele testelor se dovedesc a fi în mod evident inconsecvente cu manifestările clinice, se recomandă efectuarea unei analize cuprinzătoare a întregii legături de testare (colectarea probei, legăturile de circulație și procesare) pentru a exclude infecția precoce cu virusul SARS-CoV-2, infecția recurentă sau combinată cu alte infecții virale respiratorii, etc. posibile.Dacă condițiile permit, se recomandă recoltarea de probe mai sensibile, cum ar fi spută sau lichid de lavaj alveolar pentru reexaminare.

Produse asemanatoare:

Kit de detectare a acidului nucleic SARS-CoV-2 (metoda cu sondă fluorescentă PCR Multiplex)