• Facebook
  • linkedin
  • youtube

Verificarea performanței primerilor și sondelor în stadiul incipient al reactivilor PCR și determinarea celor mai potrivite condiții de reacție sunt premisele pentru a asigura desfășurarea fără probleme a experimentelor formale.

Deci, cum trebuie să confirmăm sonda primerului în stadiu incipient?

Principalii indicatori sunt linia de bază, curba de amplificare, valoarea ct, eficiența amplificării, detectarea probei cu concentrație scăzută, CV etc.

De bază

Linia de bază este linia orizontală din curba de amplificare PCR.În primele câteva cicluri ale reacției de amplificare PCR, semnalul de fluorescență nu se schimbă prea mult și formează o linie dreaptă.Această linie dreaptă este linia de bază.

La screeningul sondelor cu primer PCR, acordați atenție dacă linia de bază este egală.Puritatea concentrației sondei de primer va afecta linia de bază, cum ar fi determinând creșterea sau scăderea liniei de bază.Linia de bază este, de asemenea, un indicator foarte intuitiv.
Analiză

Curba de amplificare

Un alt indicator intuitiv este forma curbei de amplificare.Cel mai bine este să aveți o curbă în formă de S pentru a evita amplificarea secundară sau alte curbe de amplificare anormale.
nul

Valoarea Ct

Numărul de cicluri corespunzător punctului de inflexiune de la linia de bază la creșterea exponențială este valoarea Ct.

Pentru aceeași probă, diferite sonde de primer au ca rezultat curbe de amplificare diferite, iar valoarea Ct corespunzătoare va fi afectată de eficiența amplificării și de gradul de interferență.În teorie, cu cât valoarea Ct a sondei de primer pe care o alegem este mai mică, cu atât mai bine.

Analiza-3

Eficiența de amplificare

Una dintre cele mai fiabile și stabile metode de evaluare a eficienței amplificării PCR este curba standard, care este, de asemenea, recunoscută pe scară largă de către cercetători.Metoda implică realizarea unei serii de mostre pentru a controla numărul relativ de șabloane țintă.Aceste probe sunt de obicei realizate prin diluții în serie de soluții stoc concentrate, cea mai frecvent utilizată este diluția de 10 ori.Folosind o serie de probe diluate, folosind programul standard qPCR pentru a amplifica pentru a obține valoarea Cq și, în final, trasați o curbă standard în funcție de concentrația fiecărei probe și valoarea corespunzătoare a Cq pentru a obține ecuația liniară Cq= -klgX0+b, iar eficiența de amplificare E=10(-1 /k)-1.Când se utilizează qPCR pentru analiza cantitativă, eficiența de amplificare trebuie să fie în intervalul 90%-110% (3,6>k>3,1).

Analiza-4

Detectarea probelor cu concentrație scăzută

Când concentrația probei este scăzută, ratele de detecție ale diferitelor sonde de primer sunt diferite.Selectăm 20 de probe cu concentrație scăzută pentru a le replica, iar sistemul primer-sondă cu cea mai mare rată de detectare este cel mai bun.

Analiza-5

Coeficientul de variație (CV)

10 probe duplicate pot fi detectate cu diferite sonde de primer, conform standardului de linie al reactivului pentru detectarea amplificării acidului nucleic.

Analiza-6

Reactivi cantitativi:
Precizie
Precizia într-un singur lot trebuie să respecte: coeficientul de variație (CV,%) al valorii logaritmice a concentrației de testare este ≤5%.Când concentrația probei este scăzută, coeficientul de variație (CV,%) al logaritmului concentrației de detecție este ≤10%


Reactivi calitativi:
Precizie
Precizia dintr-un lot ar trebui să respecte:

(1) Coeficientul de variație al valorii Ct (CV,%) ≤5%

Aceeași probă este testată în paralel de 10 ori, iar rezultatele testului ar trebui să fie consecvente


Ora postării: 18-sept-2021