• Facebook
  • linkedin
  • youtube

PCR este cea mai utilizată tehnologie de amplificare a acidului nucleic și este utilizată pe scară largă datorită sensibilității și specificității sale.Cu toate acestea, PCR necesită denaturare termică repetată și nu poate scăpa de limitările de a se baza pe instrumente și echipamente, ceea ce limitează aplicarea acesteia în testarea clinică în teren.

De la începutul anilor 1990, multe laboratoare au început să dezvolte tehnologie de amplificare la temperatură constantă care nu necesită denaturare termică.Acum au dezvoltat tehnologia de amplificare izotermă mediată de buclă, tehnologia de amplificare izotermă de înlocuire a firelor, tehnologia de amplificare izotermă cu cerc rulant și dependența de secvența de acid nucleic.Tehnologia de amplificare izotermă și alte tehnologii. 

Lamplificare izotermă mediată de oop

Principiul de amplificare se bazează pe faptul că ADN-ul se află într-o stare de echilibru dinamic la aproximativ 65°C.Când orice primer este pereche de baze și extins la partea complementară a ADN-ului dublu catenar, cealaltă catenă se va disocia și va deveni monocatenară.

La această temperatură, ADN-ul folosește 4 primeri specifici pentru a se baza pe o ADN polimerază cu deplasare a catenei pentru a face ca sinteza ADN-ului cu deplasare a catenei să se auto-circuleze continuu.

Mai întâi determinați cele 6 regiuni specifice F3, F2, F1, B1, B2, B3 pe gena țintă și apoi proiectați 4 primeri pe baza acestor 6 regiuni specifice (așa cum se arată în figura de mai jos):

Primerul interior înainte (FIP) este compus din F1c și F2.

Primerul interior înapoi (BIP) este compus din B1c și B2, iar TTTT este folosit ca distanțier în mijloc.

Primerii exteriori F3 și B3 sunt compuși, respectiv, din regiuni F3 și B3 de pe gena țintă.

Tehnologia de amplificare izotermă a acidului nucleic

În sistemul de reacție LAMP, concentrația primerului interior este de câteva ori mai mare decât a primerului exterior.Primerul interior este mai întâi combinat cu catena matriță pentru a sintetiza o catenă complementară pentru a forma o catenă dublă ADN.Ulterior, primerul exterior este combinat cu catena matriță pentru a forma o catenă dublă ADN.Sub acțiunea BstDNA polimerazei, catena complementară sintetizată de primerul interior este eliberată.După o serie de reacții, catena complementară formează în cele din urmă o singură catenă de ADN cu o structură de gantere.

Structura ADN-ului cu un singur caten în sine este folosită ca șablon pentru a forma continuu o structură de ADN tranzițională cu tulpină-buclă cu un capăt deschis.Primerii interiori și exteriori ghidează ADN-ul structurii tulpină-bucla de tranziție pentru a suferi continuu reacții de deplasare și extensie a catenei și, în final, formează mai multe structuri tulpină-buclă cu lungimi diferite.amestec de ADN.

Tehnologia de amplificare izotermă a acidului nucleic2

Avantajele și dezavantajele amplificării izoterme mediate de buclă

Avantajele LAMP:

(1) Eficiență ridicată de amplificare, care poate amplifica eficient 1-10 copii ale genei țintă în decurs de 1 oră, iar eficiența de amplificare este de 10-100 de ori mai mare decât PCR obișnuită.

(2) Timpul de reacție este scurt, specificitatea este puternică și nu este necesar niciun echipament special.

Deficiențele LAMP:

(1) Cerințele pentru grunduri sunt deosebit de ridicate.

(2) Produsul amplificat nu poate fi folosit pentru clonare și secvențiere, ci poate fi folosit doar pentru judecată.

(3) Datorită sensibilității sale puternice, este ușor să se formeze aerosoli, provocând fals pozitive și afectând rezultatele testelor.

Samplificarea prin deplasare a trandului

Strand displacement amplification (SDA) este o tehnică de amplificare izotermă a ADN in vitro, bazată pe reacția enzimatică propusă pentru prima dată de savantul american Walker în 1992.

Sistemul de bază al SDA include o endonuclează de restricție, o ADN polimerază cu activitate de deplasare a catenei, două perechi de primeri, dNTP și ioni de calciu și magneziu și sisteme tampon.

Principiul amplificării cu deplasarea catenei se bazează pe secvența de recunoaștere a endonucleazei de restricție modificată chimic la ambele capete ale ADN-ului țintă.Endonucleaza deschide golul din catena ADN la locul său de recunoaștere, iar ADN polimeraza extinde golul 3′ Capătul și înlocuiește următoarea catenă de ADN.

Catenele simple înlocuite de ADN pot fi combinate cu primeri și extinse în catenele duble de către ADN polimeraza.Acest proces se repetă continuu, astfel încât secvența țintă să fie amplificată eficient.

Tehnologia de amplificare izotermă a acidului nucleic3

Avantajele și dezavantajele tehnologiei de amplificare cu deplasare a firelor

Avantajele SDA:

Eficiența de amplificare este mare, timpul de reacție este scurt, specificitatea este puternică și nu este nevoie de echipamente speciale.

Deficiențe ale SDA:

Produsele nu sunt uniforme, iar unele produse monocatenare și dublu catenare sunt întotdeauna produse în ciclul SDA, iar coada va apărea inevitabil atunci când sunt detectate prin electroforeză.

Ramplificarea cercului olling

Amplificarea cu cerc rulant (RCA) este propusă bazându-se pe metoda copierii ADN-ului de la organisme patogene prin cerc rulant.Se referă la utilizarea ADN-ului circular monocatenar ca șablon la o temperatură constantă și a unei ADN polimeraze speciale (cum ar fi Phi29) ) Sub acțiunea sintezei ADN-ului cu cerc rulant pentru a obține amplificarea genei țintă.

RCA poate fi împărțit în amplificare liniară și amplificare exponențială.Eficiența RCA liniară poate ajunge la 105ori, iar eficiența RCA exponențială poate ajunge la 109ori.

O distincție simplă, așa cum se arată în figura de mai jos, amplificarea liniară a folosește doar 1 primer, amplificarea exponențială b are 2 primeri.

Tehnologia de amplificare izotermă a acidului nucleic4

Linear RCA se mai numește și single primer RCA.Un primer se leagă de ADN circular și este extins prin acțiunea ADN polimerazei.Produsul este o singură catenă liniară cu un număr mare de secvențe repetitive de mii de ori lungimea unei singure bucle.

Deoarece produsul RCA liniar este întotdeauna conectat la primerul de pornire, fixarea ușoară a semnalului este un avantaj major.

RCA exponențial, cunoscut și sub denumirea de amplificare hiper ramificată HRCA (Hyper ramificată RCA), în RCA exponențial, un primer primer amplifică produsul RCA, al doilea primer hibridizează cu produsul RCA și se extinde, iar înlocuirea este deja legată de produsul RCA Primerii din aval extind catena și repetă extensia și înlocuirea pentru a produce un produs de dendritică RCA.

Tehnologia de amplificare izotermă a acidului nucleic5

Avantajele și dezavantajele amplificării acidului nucleic cu cerc rulant

Avantajele RCA:

Sensibilitate ridicată, specificitate bună și operare ușoară.

Deficiențe ale RCA:

Probleme de fundal în timpul detectării semnalului.În timpul reacției RCA, sonda lacăt necirculată și ADN-ul șablon sau ARN-ul sondei nelegate pot genera unele semnale de fundal. 

Namplificare bazată pe secvența ucleicacid

Amplificarea pe bază de secvență de acid nucleic (NASBA) este o nouă tehnologie dezvoltată pe baza PCR.Este o amplificare continuă și izotermă a acidului nucleic ghidată de o pereche de primeri cu o secvență de promotor T7.Tehnologia poate amplifica ARN-ul șablon de aproximativ 109 ori în aproximativ 2 ore, ceea ce este de 1000 de ori mai mare decât metoda PCR convențională și nu necesită echipament special.

Această tehnologie a fost folosită pentru diagnosticarea rapidă a bolilor de îndată ce a apărut, iar multe companii folosesc în prezent această metodă în trusele de detectare a ARN.

Deși amplificarea ARN poate folosi și tehnologia PCR cu transcripție inversă, NASBA are propriile sale avantaje: poate fi efectuată în condiții de temperatură relativ constantă și este mai stabilă și mai precisă decât tehnologia PCR tradițională.

Reacția este la 41 de grade Celsius și necesită transcriptază inversă AMV (virusul mieloblastozei aviare), RNază H, ARN polimerază T7 și o pereche de primeri pentru a se finaliza.

Procesul include în principal:

Primerul direct conține secvența complementară a promotorului T7.În timpul reacției, primerul direct se leagă de catena de ARN și este catalizat de enzima AMV pentru a forma o catenă dublă ADN-ARN.

RNaza H digeră ARN-ul în hibridul dublu catenar și reține ADN-ul monocatenar.

Sub acțiunea primerului invers și a enzimei AMV, se formează o dublă catenă ADN care conține secvența promotorului T7.

Sub acțiunea ARN polimerazei T7, procesul de transcripție este finalizat și se produce o cantitate mare de ARN țintă.

Tehnologia de amplificare izotermă a acidului nucleic6

Avantajele NASBA:

(1) Primerul său are o secvență de promotor T7, dar ADN-ul străin dublu catenar nu are o secvență de promotor T7 și nu poate fi amplificat, astfel încât această tehnologie are specificitate și sensibilitate ridicate.

(2) NASBA încorporează direct procesul de transcriere inversă în reacția de amplificare, scurtând timpul de reacție.

Dezavantajele NASBA:

(1) Componentele de reacție sunt mai complicate.

(2) Sunt necesare trei tipuri de enzime pentru a crește costul reacției.


Ora postării: Aug-06-2021