Câteva invenții revoluționare din istoria tehnologiei de detectare în mintea mea sunt tehnologia de imunomarcare bazată pe principiul legării specifice antigen-anticorp, tehnologia PCR și tehnologia de secvențiere.Astăzi vom vorbi despre tehnologia PCR.Conform evoluției tehnologiei PCR, oamenii împart în mod obișnuit tehnologia PCR în trei generații: tehnologia PCR obișnuită, tehnologia PCR cantitativă fluorescentă în timp real și tehnologia PCR digitală.
Ctehnica comună PCR
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis a inventat reacția în lanț a polimerazei (reacția în lanț a polimerazei, PCR) în 1983. Se spune că, atunci când își conducea prietena, a avut brusc un fulger de inspirație și s-a gândit la principiul PCR (cu privire la beneficiile condusului).Kary Mullis a primit Premiul Nobel pentru Chimie în 1993. The New York Times a comentat: „Foarte original și semnificativ, aproape împărțind biologia în epoci pre-PCR și post-PCR.
Principiul PCR: Sub cataliza ADN polimerazei, ADN-ul catenei mamă este utilizat ca matriță, iar primerul specific este utilizat ca punct de plecare al extensiei, iar ADN-ul catenei fiice complementare ADN-ului catenei mamă este copiat in vitro prin denaturare, recoacere, extensie și alte etape.Este o tehnologie de amplificare a sintezei ADN in vitro, care poate amplifica rapid și specific orice ADN țintă in vitro.
Avantajele PCR obișnuite
1.Metoda clasica, standarde internationale si interne complete
2.Cost mai mic al reactivilor pentru instrumente
3.Produsele PCR pot fi recuperate pentru alte experimente de biologie moleculară
Aparat recomandat de PCR Foregene: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Produse înrudite: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Dezavantajele PCR obișnuite
1.usor de poluat
2.operație greoaie
3.doar analiză calitativă
4.Sensibilitate moderată
5.Există o amplificare nespecifică, iar când banda nespecifică are aceeași dimensiune cu banda țintă, nu poate fi distinsă
CPCR pe bază de electroforeză apilară
Ca răspuns la deficiențele PCR obișnuite, unii producători au introdus instrumente bazate pe principiul electroforezei capilare.Etapa de electroforeză după amplificarea PCR este finalizată în capilar.Sensibilitatea este mai mare, iar diferența mai multor baze poate fi distinsă și amplificarea poate fi calculată de MAERKER.continutul produsului.Dezavantajul este că produsul PCR trebuie încă deschis și introdus în instrument și există încă un risc mare de contaminare.
CapilarăEelectroforeza
2. Tehnologie PCR cantitativă fluorescentă în timp real (PCR în timp real cantitativ, qPCR)PCR cantitativă fluorescentă, numită și PCR în timp real, este o nouă tehnologie cantitativă a acizilor nucleici dezvoltată de PE (Perkin Elmer) în 1995. Istoria dezvoltării PCR cantitativă fluorescentă este o istorie a luptelor emoționante ale unor giganți precum ABI, Roche și Bio-Rad.Dacă sunteți interesat, îl puteți verifica.Această tehnică este în prezent cea mai matură și utilizată tehnică PCR semi-cantitativă.
Aparat qPCR recomandat: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Metoda vopselei fluorescente (SYBR Green I):SYBR Green I este colorantul de legare la ADN cel mai frecvent utilizat pentru PCR cantitativ, care se leagă nespecific de ADN-ul dublu catenar.În stare liberă, SYBR Green emite fluorescență slabă, dar odată legat de ADN-ul dublu catenar, fluorescența acestuia crește de 1000 de ori.Prin urmare, semnalul fluorescent total emis de o reacție este proporțional cu cantitatea de ADN dublu catenar prezent și va crește odată cu creșterea produsului amplificat.Deoarece colorantul se leagă nespecific de ADN-ul dublu catenar, pot fi generate rezultate fals pozitive.
Produse înrudite: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Metoda sondei fluorescente (tehnologia Taqman): În timpulAmplificarea PCR, o sondă fluorescentă specifică este adăugată în același timp cu o pereche de primeri.Sonda este o oligonucleotidă liniară, cu un grup reporter fluorescent și, respectiv, un grup de extindere fluorescent marcate la ambele capete.Când sonda este intactă, semnalul fluorescent emis de grupul reporter este absorbit de grupul de extindere, iar detecția Nu există semnal fluorescent;în timpul amplificării PCR (în stadiul de extensie), activitatea 5’-3’ Dicer a enzimei Taq va digera și degrada sonda, astfel încât grupul fluorescent reporter și grupul fluorescent stingător să fie separate, astfel încât sistemul de monitorizare a fluorescenței Semnalul fluorescent poate fi recepționat, adică de fiecare dată când un lanț de ADN este amplificat, o moleculă fluorescentă completă de sincronizare realizează semnalul fluorescent de acumulare completă. s și formarea produselor PCR.Metoda sondei Taqman este cea mai utilizată metodă de detectare în detecția clinică.
Produse similare: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Avantajele qPCR
1.Metoda este matură, iar echipamentele de susținere și reactivii sunt complete
2.Costul mediu al reactivilor
3.ușor de folosit
4.Sensibilitate și specificitate ridicate la detecție
Dezavantajele qPCR
Mutația genei țintă duce la detectarea ratată.
Rezultatul detectării șablonului cu concentrație scăzută nu poate fi determinat.
Există o eroare mare atunci când se utilizează curba standard pentru detectarea cantitativă.
3. Tehnologia digital PCR (digital PCR, dPCR).
PCR digitală este o tehnică de cuantificare absolută a moleculelor de acid nucleic.În comparație cu qPCR, PCR digitală poate citi direct numărul de molecule de ADN/ARN, care este cuantificarea absolută a moleculelor de acid nucleic din proba de pornire.În 1999, Bert Vogelstein și Kenneth W. Kin-zler au propus în mod oficial conceptul de dPCR.
În 2006, Fluidigm a fost primul care a produs un instrument comercial bazat pe cip dPCR.În 2009, Life Technologies a lansat sistemele OpenArray și QuantStudio 12K Flex dPCR.În 2013, Life Technologies a lansat sistemul QuantStudio 3DdPCR, care utilizează tehnologia de cip microfluidic la scară nanometrică de înaltă densitate pentru a distribui uniform probe la 20.000 de celule individuale.în bine de reacție.
În 2011, Bio-Rad a lansat instrumentul QX100 dPCR pe bază de picături, care utilizează tehnologia apă în ulei pentru a distribui uniform proba la 20.000 de picături de apă în ulei și utilizează un analizor de picături pentru a analiza picăturile.În 2012, RainDance a lansat instrumentul RainDrop dPCR, condus de gaz de înaltă presiune, pentru a împărți fiecare sistem de reacție standard într-o emulsie de reacție care conține 1 milion până la 10 milioane de micro-picături la nivel de picoliter.
Până acum, PCR-ul digital a format două facțiuni majore, tip cip și tip picătură.Indiferent de ce fel de PCR digitală, principiile sale de bază sunt limitarea diluției, PCR finală și distribuția Poisson.Sistemul standard de reacție PCR care conține șabloane de acid nucleic este împărțit uniform în zeci de mii de reacții PCR, care sunt distribuite pe cipuri sau micropicături, astfel încât fiecare reacție să conțină cât mai mult posibil o moleculă șablon și se realizează o reacție PCR cu o singură moleculă.Prin citirea fluorescenței Se numără prezența sau absența semnalului, iar cuantificarea absolută se realizează după calibrarea distribuției statistice Poisson.
Următoarele sunt caracteristicile mai multor platforme digitale PCR pe care le-am folosit:
1. PCR digital cu picături Bio-Rad QX200 Bio-RadQX200 este o platformă PCR digitală foarte clasică, procesul de detectare de bază: 20.000 de probe sunt generate de generatorul de picături Micro-picăturile de apă în ulei sunt amplificate pe o mașină PCR obișnuită, iar în final semnalul de fluorescență al fiecărei micro-picături este citit de un cititor de micro-picături.Operațiunea este mai complicată, iar riscul de poluare este mediu.
PCR digitală cu micro-picături Xinyi TD1Xinyi TD1 este o platformă PCR digitală internă, procesul de detectare de bază: generați 30.000-50.000 de picături de apă în ulei printr-un generator de picături, amplificați pe un instrument PCR obișnuit și, în cele din urmă, trece Cititorul de picături citește semnalul fluorescent al fiecărei picături.Atât generarea picăturilor, cât și citirea în această platformă sunt efectuate într-un cip dedicat cu risc scăzut de contaminare.
STILLA Naica micro-picături cip digital PCRSTILLA Naica este o platformă digitală PCR relativ nouă.Procesul de detectare de bază este: adăugați soluția de reacție la cip, introduceți cip-ul în sistemul de generare și amplificare a micro-picături și generați 30.000 de micro-picături.Răspândiți pe cip și amplificarea PCR este finalizată pe cip.Apoi, cipul amplificat este transferat în sistemul de analiză a citirii cu micro-picături, iar semnalul fluorescent este citit prin realizarea de fotografii.Deoarece întregul proces are loc într-un cip închis, riscul de contaminare este scăzut.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D chip digital PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D este o altă platformă PCR digitală clasică bazată pe cip.Procesul său de detectare de bază este: adăugați soluția de reacție în distribuitor și răspândiți soluția de reacție uniform pe cip cu 20.000 de microgodeuri prin distribuitor., puneți cipul pe aparatul PCR pentru a amplifica și, în final, puneți cipul în cititor și faceți o fotografie pentru a citi semnalul fluorescent.Operația este relativ complicată, iar întregul proces se desfășoară într-un cip închis, iar riscul de contaminare este scăzut.
5. PCR digitală cu cip JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity este o platformă PCR digitală de tip cip relativ nouă.Procesul său de bază de detectare este: adăugați soluția de reacție în aplicator și răspândiți soluția de reacție uniform pe 10.000 de tuburi PCR fixate în tubul PCR prin aplicator.Pe cipul microporos, soluția de reacție intră în cip prin acțiune capilară, iar tubul PCR cu cip este plasat pe mașina PCR pentru amplificare, iar în cele din urmă cipul este introdus în cititor pentru a citi semnalul fluorescent făcând o fotografie.Operația este mai complicată.Riscul de contaminare este scăzut.
Parametrii fiecărei platforme PCR digitale sunt rezumați după cum urmează:
Indicatorii de evaluare ai platformei digitale PCR sunt: numărul de unități split, numărul de canale fluorescente, complexitatea funcționării și riscul de contaminare.Dar cel mai important lucru este acuratețea detectării.O modalitate de a evalua platformele digitale PCR este utilizarea mai multor platforme digitale PCR pentru a se verifica reciproc, iar o altă modalitate este utilizarea substanțelor standard cu valori precise.
Avantajele dPCR
1.Realizarea cuantificării absolute
2.Sensibilitate și specificitate mai mare
3.Poate detecta eșantioane de copiere redusă
Dezavantajele dPCR1. Echipament și reactivi scumpi 2. Funcționare complicată și timp lung de detectare 3. Interval de detecție îngust
În prezent, cele trei generații de tehnologie PCR au propriile avantaje și dezavantaje și fiecare are propriile domenii de aplicare și nu este o relație ca o generație să o înlocuiască pe cealaltă.Avansarea continuă a tehnologiei a injectat o nouă vitalitate tehnologiei PCR, permițându-i să deblocheze o direcție de aplicare după alta, făcând detectarea acidului nucleic mai convenabilă și mai precisă.
Sursa: Dr. Yuan te duce la testare
Produse Recomandate:
Ora postării: 18-11-2022
