• Facebook
  • linkedin
  • youtube

Specificitatea detectării

În cele mai multe cazuri, scopul designului primerului este de a maximiza specificitatea PCR.Acest lucru este determinat de influența mai mult sau mai puțin previzibilă a multor variabile.O variabilă importantă este secvența de la capătul 3′ al primerului.

Este important că testele PCR concepute pentru specificitate au mai multe șanse să mențină o eficiență ridicată pe un interval dinamic larg, deoarece testul nu produce produse de amplificare nespecifice, concurând astfel cu reactivii PCR sau inhibând reacția principală de amplificare.

Desigur, în unele cazuri, specificitatea nu este cea mai importantă, de exemplu, atunci când scopul este de a cuantifica agenți patogeni strâns legați, dar diferiți, sunt necesare standarde speciale de proiectare, optimizare și verificare.

Curba de topire este o metodă standard pentru evaluarea specificității ampliconilor, cel puțin în ceea ce privește amplificarea unei singure ținte.Cu toate acestea, trebuie subliniat că curbele de topire pot induce în eroare deoarece, de exemplu, ele pot fi afectate de efectele combinate ale primerilor suboptimi și ale concentrațiilor scăzute ale șablonului.

sadf

P5 |Curba de topire arată deplasările Tm obținute din două detectări de cantități diferite de două ADN-uri țintă.

A. La concentrații mai mari (ad)), nu există un dimer de primer evident după ce măsurarea qPCR este finalizată.Pe măsură ce concentrația șablonului scade la 50 de copii (e), începe să apară un produs nespecific și devine singurul produs la cea mai mică concentrație (f).

B. Testul a înregistrat aceleași Tms la toate concentrațiile țintă și nu a existat un dimer de primer evident chiar și la cea mai mică concentrație (5 copii).Când se utilizează aceste două metode de detectare, nu au fost detectați produse de amplificare în NTC.

P5 arată curbele de dizolvare obținute cu probe în care șablonul este prezent la diferite concentrații.P 5a arată că la cele două concentrații cele mai scăzute, Tm-urile produselor de amplificare nespecifice produse sunt mai mici decât cele ale ampliconilor specifici.

Evident, această metodă de detectare nu poate fi utilizată în mod fiabil pentru a detecta ținte care există în concentrații scăzute.

Interesant, NTC-urile, adică probele fără ADN deloc, nu au înregistrat produse de amplificare (nespecifice), indicând faptul că ADN-ul genomic de fond poate participa la amplificarea/polimerizarea nespecifică.

Uneori, astfel de primeri de fond și amplificare nespecifică nu pot fi remediate, dar este adesea posibil să se proiecteze o metodă de detectare care să nu aibă amplificare nespecifică în nicio concentrație de șablon și NTC (P 5b).

Aici, chiar și înregistrarea amplificării concentrației țintă cu un Cq de 35 va produce o curbă de dizolvare specifică.În mod similar, NTC-urile nu au prezentat semne de amplificare nespecifică.Uneori, comportamentul de detectare poate fi dependent de lichidul mamă, și numai amplificarea nespecifică este detectată în anumite compoziții tampon, care pot fi legate de diferite concentrații de Mg2+.

Stabilitatea detectării

Optimizarea Ta este un pas util în procesul de verificare empirică și optimizare a detecției qPCR.Oferă o indicație directă a robusteței setului de primer, arătând temperatura (sau intervalul de temperatură) care produce cel mai scăzut Cq fără a amplifica NTC.

Diferența de sensibilitate de două până la patru ori poate să nu fie importantă pentru persoanele cu expresie ridicată a ARNm, dar pentru testele de diagnosticare, poate însemna diferența dintre rezultatele pozitive și fals negative.

Proprietățile Ta ale primerilor qPCR pot varia foarte mult.Unele teste nu sunt foarte robuste, iar dacă nu sunt efectuate sub valoarea optimă a Ta a primerilor, se vor prăbuși rapid.

Acest lucru este important deoarece acest tip de detectare este adesea problematic în lumea reală, iar puritatea probei, concentrația de ADN sau prezența altui ADN pot să nu fie optime.

În plus, numărul de copii țintă poate varia într-o gamă largă, iar reactivii, ustensilele din plastic sau instrumentele pot fi diferite de cele utilizate la configurarea testului.

faf

P6|Gradientul de temperatură arată robustețea diferită a detecției PCR.

A. Utilizați Mastermix-ul Sensifast SYBR de la Bioline (număr de catalog BIO-98050) pentru a efectua PCR pe ADNc preparat din ARN-ul creierului uman.

B. Utilizați instrumentul CFX qPCR Bio-Rad pentru a înregistra harta de amplificare și curba de dizolvare a apalenei (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCCTAGG).

C. Graficul de amplificare și curba de topire a ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Graficul de amplificare și curba de dizolvare a GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs înregistrate la diferite temperaturi de recoacere, arătând diferența de Cq înregistrată sub un gradient de temperatură de 7C.

P 6 arată un rezultat tipic al unui test nedorit, în care qPCR a fost efectuat folosind un gradient Tas între 59C și 67C (P 6a), folosind primeri pentru trei gene specifice creierului uman.

Se poate observa din graficul de amplificare că primerii Opalin sunt departe de a fi ideali, deoarece intervalul lor optim Ta este foarte îngust (Figura 6b), adică Cq-urile sunt dispersate pe scară largă, ceea ce duce la compararea semnificativă a Cq-urilor cu Cq-urile lor optime scăzute.

Această metodă de detectare este instabilă și poate duce la o amplificare suboptimă.Prin urmare, această pereche de grunduri ar trebui reproiectată.În plus, analiza curbei de topire (inserție) arată că specificitatea acestei metode de detectare poate fi, de asemenea, problematică, deoarece curba de topire a fiecărui Ta este diferită.

Metoda de detectare ACSBG1 prezentată în P 6c este mai robustă decât metoda de detectare Opalin de mai sus, dar este încă departe de a fi ideală și este probabil să poată fi îmbunătățită.

Totuși, subliniem că nu există o legătură necesară între robustețe și specificitate, deoarece curba de dizolvare produsă de această metodă de detectare arată aceeași valoare de vârf în toate Tas (inserția).

Pe de altă parte, testul de robustețe este mult mai tolerant, producând Cq similare într-o gamă largă de Tas, ca în testul GFAP prezentat în P 6d.

Diferența de Cqs obținută în același interval de 8 grade Celsius este mai mică de 1, iar curba de dizolvare (inserție) confirmă caracteristicile de detecție în acest interval de temperatură.Este de remarcat faptul că Tas calculat și intervalul Ta real pot fi foarte diferite.

Există multe linii directoare concepute pentru a ajuta cercetătorii să proiecteze primeri eficiente, majoritatea fiind bazate pe reguli stabilite de mult timp și s-a acordat multă atenție capătului 3 al primerilor.Este adesea recomandat să includeți un G sau C la capătul 3’ și două baze G sau C (clemă GC), dar nu mai mult de două dintre ultimele 5 baze.

În practică, aceste reguli pot ghida cercetătorii, dar nu sunt neapărat corecte în toate circumstanțele.

saf

P7 |Capătul 3 al primerului are un efect redus asupra specificității sau eficienței.

A. Poziția primerilor pentru gena HIF-1a umană (NM_181054.2).

B. Utilizați soluția mamă Agilent Brilliant III SYBR Green (nr. cat. 600882) pentru a amplifica șase elemente de testare.

C. Graficul de amplificare și curba de topire înregistrate de instrumentul CFX qPCR de la Bio-Rad și primeri 3′.NTC-urile sunt afișate cu roșu.

D. Înregistrarea Cqs a fiecărui element de testare

De exemplu, rezultatul din P 7 contrazice regula 3′cap.Toate modelele produc practic aceleași rezultate, doar două combinații de primeri conducând la amplificare nespecifică în NTC.

Cu toate acestea, nu putem susține efectul clipului GC, deoarece în acest caz, utilizarea A sau T ca maximum 30 de baze nu reduce specificitatea.

Testul C, unde primerul F se termină în GGCC, a înregistrat Cq-uri în NTC-uri, indicând că s-ar putea dori să se evite aceste secvențe la capătul 30.Subliniem că singura modalitate de a determina cea mai bună secvență de capăt 3′ a unei perechi de primeri este evaluarea experimentală a unor primeri candidați.

Eficienta de amplificare

Este important, deși detectarea nespecifică PCR nu poate deveni niciodată specifică, eficiența amplificării poate fi ajustată și maximizată în multe moduri diferite prin schimbarea enzimei, lichidului mamă, aditivilor și condițiilor de ciclu.

Pentru a evalua eficiența detectării PCR, cel mai bine este să utilizați o diluție în serie de 10 sau 5 ori acidul nucleic țintă, adică „metoda curbei standard”.

Dacă se utilizează ampliconi PCR sau ținte ADN sintetice pentru a genera o curbă standard, diluțiile în serie ale acestor ținte trebuie amestecate cu o cantitate constantă de ADN de fond (cum ar fi ADN-ul genomic).

fds

P8 |Curba de diluție pentru evaluarea eficienței PCR.

A. Utilizați primeri pentru HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA și R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC și mastermix Agilent's Brilliant III SYBR Green (număr de catalog 600882) pentru PCR și condițiile curbei de topire.

B. 100 ng ARN au fost transcrise invers, diluate de 2 ori, iar probele de ADNc diluate în serie au fost diluate de 5 ori la 1 ng ADN genomic uman.Curba de topire este prezentată în insert.

C. Reacția RT, diluția și diluția în serie au fost repetate pentru a doua probă de ADNc și rezultatele au fost similare.

P 8 prezintă două curbe standard, folosind aceeași metodă de detectare pe două probe diferite de ADNc, rezultatul este aceeași eficiență, aproximativ 100%, iar valoarea R2 este, de asemenea, similară, adică gradul de potrivire dintre datele experimentale și linia de regresie sau gradul de liniaritate al datelor.

Cele două curbe standard sunt comparabile, dar nu exact aceleași.Dacă scopul este de a cuantifica cu exactitate ținta, trebuie remarcat că este inacceptabil să se furnizeze un calcul al numărului de copii fără a explica incertitudinea

trist

P9 |Incertitudinea de măsurare asociată cu cuantificarea folosind o curbă standard.

A. Utilizați primeri pentru GAPDH (NM_002046) pentru a efectua PCR și condițiile curbei de topire.F: ACAGTTGCCATGTAGACC și R: TAACTGGTTGAGCACAGG și Mastermix Sensifast SYBR de la Bioline (număr de catalog BIO-98050).

B. Diagrama de amplificare, curba de topire și curba standard înregistrate cu instrumentul CFX qPCR de la Bio-Rad.

C. Graficul curbei standard și intervalul de încredere (IC) de 95%.

D. Numărul de copii și intervalul de încredere de 95% al ​​celor trei valori Cq derivate din curba de diluție.

P 9 arată că pentru un test optimizat, variabilitatea inerentă a unei singure curbe standard este de aproximativ 2 ori (interval de încredere de 95%, de la minim la maxim), care poate fi cea mai mică variabilitate la care se poate aștepta.

Produs inrudit:

Kit Cell Direct RT qPCR

Kit PCR Mouse Tail Direct

Kit PCR direct Animal Tissue


Ora postării: 30-sept-2021