• Facebook
  • linkedin
  • youtube

Reverse transcriptazele tradiționale nu pot tolera temperaturi ridicate (temperatura optimă pentru activitatea MMLV este de 37-50°C, iar AMV este de 42-60°C).ARN-ul viral mai complex nu poate fi transcris invers în mod eficient în ADNc la temperaturi scăzute, rezultând eficiența detectării.RT-qPCR tradițională necesită, în general, participarea a două enzime cheie (reverse transcriptaza și ADN polimeraza), ceea ce face imposibilă simplificarea funcționării sistemului de reacție și reducerea costurilor.Aici vom introduce două transcriptaze inverse rezistente la temperaturi ridicate, TtH și RevTaq.Aceste două enzime au și funcția de ADN polimerazei, așa că sunt numite enzime bifuncționale.

ADN polimeraza TtH

Probabil că ați auzit despre TtH, care este derivat din bacteria termofilă Thermus thermophilus HB8.În prezența cationilor divalenți, cum ar fi Mg2+, are activitate ADN polimerază.Este utilizat pe scară largă în reacțiile PCR, cum ar fi enzima Taq, dar are o rezistență mai mare la căldură decât enzima Taq, deci are, de asemenea, un efect mai bun asupra PCR cu șabloane cu conținut ridicat de GC.

· Această enzimă nu are activitate exonuclează 3′→5′ și activitate exonuclează 5′→3′, deci poate fi folosită și pentru secvențierea dideoxi.

· Această enzimă are activitate RTază.În prezența Mn2+, activitatea RTază va fi îmbunătățită.Folosind această caracteristică, poate fi utilizată pentru a efectua reacția de transcripție inversă și reacția PCR în același tub, adică RT-PCR într-un singur pas.Cu toate acestea, în prezența Mn2+, acuratețea RT-PCR nu este mare.Activitatea RT nu are nimic de-a face cu activitatea rnaazei H.

· Activitatea crescută a polimerazei Tth-ADN (pH9, optim +55℃~+70℃, maxim +95℃) depășește problemele cauzate de structura secundară a ARN.ADNc rezultat poate fi amplificat prin PCR cu aceeași enzimă în prezența ionilor Mg2+.

· Capacitatea Tth-ADN polimerazei de a efectua transcripție inversă și amplificare ADN la temperaturi ridicate face ca această enzimă să fie utilă pentru RT-PCR cantitativ, clonare și analiza expresiei genice a ARN-ului celular și viral.
· Tth-ADN polimeraza este utilizată pentru RT-PCR pentru a amplifica ARN-ul până la 1 kb.

nul
 

Caracteristici și avantaje

ADN polimeraza a treia:

• Asigurați dimensiunea optimizată a produsului de reacție în lanț a polimerazei (PCR), cel puțin 1000 bp în reacția RT-PCR

• Acceptați trifosfatul dezoxiribonucleozid modificat ca substrat

• Nu are legătură cu activitatea RNazei H

• Are stabilitate termică ridicată pentru a depăși probleme, de obicei legate de structura secundară ridicată prezentă în ARN

RevTaq RT-PCR ADN polimeraza

O ADN polimerază rezistentă la căldură cu activitate de transcriptază inversă

RevTaq-RT-PCR-ADN polimeraza este o enzimă cu dublă funcționare, proiectată, foarte rezistentă la căldură, cu activități de transcriptază inversă și ADN polimerază, obținute prin evoluție dirijată și artificială.

· Timpul de înjumătățire al ADN polimerazei RevTaq RT-PCR la 95°C este mai mare de 40 de minute.

· RevTaq RT-PCR ADN polimeraza permite transcripția inversă la temperatură înaltă direct din șablonul ARN, iar etapa de transcriere inversă poate fi repetată de mai multe ori pentru a genera mai multe șabloane de ADNc.

· RevTaq RT-PCR ADN polimeraza permite RT-PCR în „etapă zero” (fără etapă de transcripție inversă izotermă), deoarece în etapa de extensie PCR ciclică, transcrierea inversă și amplificarea ADN-ului au loc simultan.Acest lucru promovează, de asemenea, reacția de transcripție inversă la temperaturi ridicate, minimizând astfel problemele întâlnite în topirea structurii secundare puternice din ARN la temperaturi ridicate.

· Datorită formulei de pornire la cald pe bază de aptamer, ADN polimeraza RevTaq RT-PCR va produce rezultate mai bune atunci când temperatura de recoacere și extensie este mai mare de 57°C.

· Deoarece enzima este rezistentă la căldură, se recomandă proiectarea primerilor și a sondelor cu puncte de topire foarte mari (>60°C).

· Se recomandă optimizarea temperaturii etapei de recoacere/prelungire printr-un gradient de temperatură în timpul procesului de configurare a reacției.

· Cu cât temperatura este mai mare, cu atât specificitatea PCR este mai mare.Ciclul de transcripție inversă se realizează de obicei la o temperatură mai mare decât ciclul PCR, deoarece hibridizarea ADN Primer:ARN Template are de obicei un punct de topire mai mare decât ADN Primer:cDNA Template duplex.

· ADN polimeraza RevTaq RT-PCR este modificată genetic și optimizată, iar dimensiunea ampliconului este între 60-300 bp.

Limita de detectare a ADN polimerazei RevTaq RT-PCR atinge 4 copii/Doi (2)

Sistemul de reacție optimizat (stabilirea primerilor cu punct de topire ridicat) este prezentat în figură.RevTaq RT-PCR RT-PCR condusă de ADN polimerază prezintă o sensibilitate mai bună decât amestecul principal RT-qPCR TaqPath în 1 etapă și un gradient de diluare a probei de detecție mai scăzut.

Mai multe avantaje:

Funcția de pornire rapidă → Pasul inițial de denaturare termică poate fi omis.

Formula aptamer cu pornire la cald → Oferă activitate enzimatică 100% imediat și previne amplificarea nespecifică la temperaturi scăzute (<57°C).

Funcția de scindare → Etapa de extracție a ARN este omisă, deoarece ADN polimeraza RevTaq RT-PCR poate procesa și mostre de reacție brute.Poate distruge imediat membranele celulare ale eucariotelor, bacteriilor și virușilor într-un ciclu fierbinte RT-PCR.

Nivel de materie primă IVD → standarde înalte de calitate și prețuri extrem de competitive


Ora postării: 12-aug-2021