Cred că toată lumea se va confrunta întotdeauna cu astfel de probleme atunci când face reacții PCR, dar cele mai multe dintre ele pot fi clasificate în două probleme principale:

Prea puțină amplificare a șablonului genei (amplificare);
Prea multă amplificare a genelor non-țintă.
Utilizarea aditivilor este una dintre strategiile comune pentru a rezolva aceste probleme.De obicei, rolul aditivilor are două aspecte:
structura secundaraa genelor (structură secundară);
Reduceți amorsarea nespecifică.
Astăzi, editorul vă va prezenta pe scurt aditivii obișnuiți în reacțiile PCR și funcțiile acestora.
Aditivi care reduc structura secundară
sulfoxid(DMSO)
mostre de genecu conținut ridicat de GC .Cu toate acestea, DMSO reduce foarte mult activitatea polimerazei Taq.Prin urmare, toată lumea trebuie să echilibreze accesibilitatea șablonului și activitatea polimerazei.Editorul sugerează că puteți încerca diferite concentrații de DSMO, cum ar fi de la 2% la 10%, pentru a găsi concentrația care se potrivește experimentului dvs.
Detergenți neionici
Detergenții neionici, cum ar fi 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 sau NP-40, reduc de obicei structura secundară a ADN-ului.Deși acest lucru poate crește amplificarea genei șablon, va cauza, de asemenea, probleme de amplificare nespecifică.Deci, acești aditivi funcționează bine pentru reacțiile PCR cu randament scăzut fără resturi, dar nu atât de bine pentru reacțiile PRC relativ impure.Un alt beneficiu al detergenților neionici este reducerea contaminării cu SDS.De obicei, în timpul procesului de extracție a ADN-ului, SDS va fi adus la etapa PCR, care inhibă foarte mult activitatea polimerazei.Prin urmare, adăugarea a 0,5% Tween-20 sau Tween-40 la reacție poate neutraliza efectele negative ale SDS.
Betaină_
Betaina poate îmbunătăți amplificarea ADN-ului prin reducerea formării structurii secundare și este, în general, un adaos „mister” la kiturile PCR comerciale.Dacă doriți să utilizați betaină, trebuie să puneți betaină sau betaină monohidrat (Betaină sau Betaine monohidrat), dar nu clorhidrat de betaină (Betaine HCl), ajustați la o concentrație finală de 1-1,7M.Betaina poate ajuta, de asemenea, la îmbunătățirea specificității, deoarece elimină dependența de compoziția perechii de baze a topirii ADN-ului/denaturarii ADN-ului.
Aditivi pentru reducerea amorsării nespecifice
Formamidă
Formamida este un aditiv organic PCR utilizat în mod obișnuit.Se poate combina cu canelura majoră și canalul minor din ADN, reducând astfel stabilitatea dublei helix ADN-ului principal și scăzând temperatura de topire a ADN-ului.Concentrația de formamidă utilizată în experimentele PCR este de obicei de 1%-5%.
tetrametilClorură de amoniu( TMAC)
Clorura de tetrametilamoniu poate crește specificitatea hibridizării (specificitatea hibridizării) și poate crește temperatura de topire a ADN-ului.Astfel, TMAC poate elimina amorsarea nespecifică și poate reduce legarea greșită a ADN-ului și ARN-ului.Dacă utilizațigrunduri degenerateîn reacția PCR, nu uitați să adăugați TMAC, care este utilizat în mod obișnuit la o concentrație de 15-100 mM.
Alți aditivi comuni
Pe lângă cele două categorii de aditivi menționate mai sus, există mulți aditivi comuni în reacțiile PCR, deși au funcții diferite, sunt și ei foarte importanți.
Ioni de magneziu
Ionul de magneziu este un cofactor (cofactor) indispensabil al polimerazei, adică fără ion de magneziu, polimeraza este inactivă.Cu toate acestea, prea mulți ioni de magneziu pot afecta și eficiența polimerazei.Concentrația ionilor de magneziu în fiecare reacție PCR va varia.Agenții de chelare (cum ar fi EDTA sau citrat), concentrația de dNTP și proteine ​​afectează toate concentrația ionilor de magneziu.Deci, dacă aveți probleme cu experimentul PCR, puteți încerca să modificați diferite concentrații de ioni de magneziu, de exemplu, de la 1,0 la 4,0 mM, cu un interval de 0,5–1 mM între ele.
Este de remarcat faptul că ciclurile multiple de îngheț-dezgheț pot duce la stratificarea concentrației soluției de clorură de magneziu.Prin urmare, trebuie să-l dizolvați complet înainte de fiecare utilizare și să-l amestecați bine înainte de a-l folosi.
Albumina serică bovină(Albumina bovină, BSA)
În experimentele de chimie moleculară, albumina serică bovină este un aditiv foarte comun, în special în digestia cu enzime de restricție și experimentele PCR.În reacțiile PCR, BSA este util în reducerea contaminanților, cum ar fi compușii fenolici.Și se mai spune că poate reduce aderența reactanților la peretele eprubetei.În reacția PCR, de obicei, concentrația de BSA adăugată poate ajunge la 0,8 mg/ml.
 
Produse asemanatoare:
Erou PCR(cu colorant)
Erou PCR