Caracteristica remarcabilă a reacției PCR este capacitatea sa mare de amplificare și sensibilitatea extrem de ridicată.Pentru a îmbunătăți performanța PCR și eficiența de detecție, ne angajăm să îmbunătățim capacitatea de amplificare PCR și sensibilitatea de detecție, dar durerea de cap este în proces de experiment.Adesea apar rezultate fals pozitive și o cantitate foarte mică de contaminare încrucișată a probei sau contaminare cu produsul PCR poate provoca rezultate fals pozitive în experiment.
Cinci tipuri de contaminare a produsului PCR
Există multe motive pentru contaminarea PCR, care pot fi împărțite aproximativ în următoarele categorii:
Contaminarea specimenului este cauzată în principal de contaminarea recipientului pentru colectarea specimenului sau, atunci când specimenul este plasat, acesta se scurge din recipient din cauza etanșării libere sau specimenul este lipit de exteriorul containerului, ceea ce provoacă contaminare încrucișată;Contaminarea duce la contaminare între specimene;unele specimene microbiene, în special viruși, se pot răspândi cu aerosoli sau forma aerosoli, rezultând o contaminare reciprocă.
Motivul principal este că în timpul preparării reactivilor PCR, pistolul de probă, recipientul, apa dublu distilată și alte soluții sunt contaminate de șablonul de acid nucleic PCR.
În laboratoarele de biologie moleculară și unele laboratoare care folosesc plasmide clonate ca martori pozitivi, problema contaminării cu plasmide clonate este de asemenea comună.Deoarece conținutul plasmidei de clonare în volum unitar este destul de mare și sunt necesare mai multe instrumente și reactivi în procesul de purificare, iar plasmida din celulele vii este foarte probabil să fie contaminată din cauza capacității puternice de creștere și reproducere a celulelor vii.
Contaminarea produselor amplificate este cea mai frecventă problemă de contaminare în reacțiile PCR.Deoarece cantitatea de copiere a produsului PCR este mare (în general 1013 copii/ml), ceea ce este mult mai mare decât limita numărului de copii de detecție PCR, o cantitate foarte mică de contaminare a produsului PCR poate provoca fals pozitive.
Poluarea cu aerosoli este cea mai probabilă formă de contaminare a produselor PCR și, de asemenea, este cea mai ușor de trecut cu vederea.Se formează prin frecarea dintre suprafața lichidului și aer.În general, contaminarea cu aerosoli se poate forma când capacul este deschis, când proba este aspirată sau chiar când tubul de reacție este agitat energic.Conform calculelor, o particulă de aerosol poate conține 48.000 de copii, așa că poluarea cauzată de aceasta este o problemă care merită o atenție deosebită.
În special, laboratoarele de testare folosesc adesea aceeași pereche de primeri pentru a testa o anumită genă.În timp, o cantitate mare de contaminare cu produsul PCR va apărea în spațiul de laborator.Odată ce apare o astfel de contaminare, este dificil să o eliminați într-un timp scurt.
Pentru primele trei tipuri de poluare, putem folosi mijloace eficiente de evitare, dar poluarea cauzată de produsele PCR este greu de prevenit, mai ales în construcția de laboratoare PCR non-standard.În procesul PCR, când vârful pipetei aspiră și suflă lichidul, iar capacul tubului PCR este deschis, se va forma un aerosol.Moleculele de ADN transportate de aerosol (un aerosol poate transporta zeci de mii de ADN) sunt greu de eliminat deoarece plutesc în aer.Odată ce următoarea rundă de experimente PCR este introdusă, vor apărea inevitabil rezultate false pozitive.
După cum se arată în figura de mai jos, controlul negativ a amplificat și banda de interes corespunzătoare:
Prima parte a acestei probleme a poluării și prevenirii PCR este introdusă aici.Următorul număr vă va aduce partea a doua „Prevenirea contaminării produselor PCR”, așa că rămâneți pe fază!
Ora postării: 25-iul-2017
