Valoarea Ct este cea mai importantă formă de prezentare a rezultatelor PCR cantitativă fluorescentă.Este folosit pentru a calcula diferențele de expresie genetică sau numărul de copii ale genelor.Deci, care este valoarea Ct a cuantificării fluorescenței considerată rezonabilă?Cum se asigură intervalul efectiv al valorii Ct?
Ce este valoarea Ct?
În timpul procesului de amplificare qPCR, numărul corespunzător de cicluri de amplificare (Cycle Threshold) când semnalul de fluorescență al produsului amplificat atinge pragul de fluorescență setat.C reprezintă Cycle și T reprezintă Prag.Mai simplu spus, valoarea Ct este numărul de cicluri corespunzător când amplificarea șablonului inițial atinge o anumită cantitate de produs în qPCR.Așa-numita „o anumită cantitate de produs” va fi explicată mai târziu.
Ce face valoarea Ct?
1. Relația dintre amplificarea exponențială, cantitatea șablonului și valoarea Ct
În mod ideal, genele din qPCR sunt acumulate prin amplificare exponențială după un anumit număr de cicluri.Relația dintre numărul de cicluri de amplificare și cantitatea de produse este: Cantitatea de produs amplificată = cantitatea inițială a șablonului × (1+En) numărul de cicluri.Cu toate acestea, reacția qPCR nu este întotdeauna într-o situație ideală.Când cantitatea de produs amplificat atinge „o anumită cantitate de produs”, numărul de cicluri în acest moment este valoarea Ct și este în perioada de amplificare exponențială.Relația dintre valoarea Ct și cantitatea de șablon de pornire: Există o relație liniară între valoarea Ct a șablonului și logaritmul numărului de copiere de început al șablonului.Cu cât concentrația inițială a șablonului este mai mare, cu atât valoarea Ct este mai mică;cu cât concentrația inițială a șablonului este mai mică, cu atât valoarea Ct este mai mare.
2. Curba de amplificare, pragul de fluorescență și o anumită cantitate de produs PCR
Cantitatea de produs de amplificare qPCR este prezentată direct sub formă de semnal fluorescent, adică curba de amplificare.În stadiul incipient al PCR, amplificarea este în condiții ideale, numărul de cicluri este mic, acumularea de produs este mică și nivelul de fluorescență nu poate fi distins clar de fondul de fluorescență.După aceea, fluorescența crește și intră în faza exponențială.Cantitatea de produs PCR poate fi detectată la un anumit punct când reacția PCR este doar în faza exponențială, care poate fi folosită ca „o anumită cantitate de produs”, iar conținutul inițial al șablonului poate fi dedus din aceasta.Prin urmare, intensitatea semnalului de fluorescență corespunzătoare unei anumite cantități de produs este pragul de fluorescență.
În etapa târzie a PCR, curba de amplificare nu mai arată amplificare exponențială și intră în faza liniară și faza de platou.
3.Reproductibilitatea valorilor Ct
Când ciclul PCR atinge numărul de ciclu al valorii Ct, tocmai a intrat în perioada de amplificare exponențială adevărată.În acest moment, eroarea mică nu a fost amplificată, astfel încât reproductibilitatea valorii Ct este excelentă, adică același șablon este amplificat în momente diferite sau în tuburi diferite în același timp.Amplificare, valoarea Ct obtinuta este constanta.
1.Eficienta de amplificare En
Eficiența amplificării PCR se referă la eficiența cu care polimeraza transformă gena care urmează să fie amplificată într-un amplicon.Eficiența de amplificare atunci când o moleculă de ADN este transformată în două molecule de ADN este de 100%.Eficiența de amplificare este exprimată în mod obișnuit ca En.Pentru a facilita analiza articolelor ulterioare, sunt introduși pe scurt factorii care afectează eficiența amplificarii.
| Factori care influențează | explicaţie | Cum sa judeci? |
| A. Inhibitori PCR | 1. ADN-ul șablon conține substanțe care inhibă reacția PCR, cum ar fi proteine sau detergenți.2. ADNc-ul după transcrierea inversă conține o concentrație mare de ARN șablon sau componente de reactiv RT, care de asemenea pot inhiba reacția PCR ulterioară. | 1. Dacă există poluare poate fi judecat prin măsurarea raportului dintre A260/A280 și A260/A230 sau electroforeza ARN.2. Dacă ADNc-ul este diluat conform unui anumit raport după transcrierea inversă. |
| B. Design necorespunzător al grundului | Amorsele nu recoace eficient | Verificați amorsele pentru amorse-dimeri sau agrafe de păr, nepotriviri și, uneori, modele intrronice. |
| C. Proiectarea necorespunzătoare a programului de reacție PCR | 1. Amorsele nu pot recoace eficient2. Eliberare insuficientă de ADN polimerază 3. Activitatea ADN-polimerazei la temperatură înaltă pe termen lung a scăzut | 1. Temperatura de recoacere este mai mare decât valoarea TM a grundului2. Timpul de pre-denaturare este prea scurt 3. Timpul fiecărei etape a procedurii de reacție este prea lung |
| D. Amestecare insuficientă a reactivilor sau erori de pipetare | În sistemul de reacție, concentrația locală a componentelor reacției PCR este prea mare sau neuniformă, rezultând o amplificare neexponențială a amplificării PCR | |
| E. Lungimea ampliconului | Lungimea ampliconului este prea mare, depășește 300 bp, iar eficiența de amplificare este scăzută | Verificați dacă lungimea ampliconului este între 80-300 bp |
| F. Influența reactivilor qPCR | Concentrația de ADN polimerazei în reactiv este scăzută sau concentrația de ioni din tampon nu este optimizată, ceea ce duce la faptul că activitatea enzimei Taq nu atinge valoarea maximă. | Determinarea randamentului de amplificare prin curba standard |
2.Intervalul valorilor Ct
Valorile Ct variază între 15-35.Dacă valoarea Ct este mai mică de 15, se consideră că amplificarea este în intervalul perioadei de referință și pragul de fluorescență nu a fost atins.În mod ideal, există o relație liniară între valoarea Ct și logaritmul numărului de copiere inițială al șablonului, adică curba standard.Prin curba standard, atunci când eficiența de amplificare este de 100%, valoarea Ct calculată pentru cuantificarea numărului de exemplare unice ale genei este în jur de 35. Dacă este mai mare de 35, numărul de copii inițial al șablonului este teoretic mai mic de 1, ceea ce poate fi considerat lipsit de sens.
Pentru diferite intervale de gene Ct, datorită diferenței dintre numărul de copii ale genei și eficiența amplificării în cantitatea de șablon inițială, este necesar să se facă o curbă standard pentru genă și să se calculeze intervalul de detecție liniară a genei.
3. Factori de influență ai valorii Ct
Din relația dintre numărul de cicluri de amplificare și cantitatea de produs: cantitatea de produs amplificat = cantitatea de șablon inițial × (1+En) numărul de ciclu, se poate observa că, în condiții ideale, cantitatea de șablon inițial și En vor avea un impact negativ asupra valorii Ct.Diferența de calitate a șablonului sau de eficiență de amplificare va face ca valoarea Ct să fie prea mare sau prea mică.
4.Valoarea Ct este prea mare sau prea mică
Ora postării: 22-feb-2023
