Autori: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Unitate: Spitalul Jiaozhou, Spitalul Dongfang Afiliat Universității Tongji

În prezent, principalul tip de probă pentru detectarea acidului nucleic patogen respirator este tamponul de gât.Există multe tipuri de soluții de conservare a probelor utilizate în mod obișnuit, toate care trebuie să fie refrigerate sau congelate pentru transport și depozitare;Este dificil de controlat întregul proces de temperatură scăzută în timpul procesului de colectare și transport și este dificil să se asigure controlul calității înainte de testarea probei^[1-2].

RNaza (RNaza) este o endonuclează care hidrolizează ARN-ul, rupând în principal legăturile fosfodiesterice dintre nucleotide.Molecula de RNază este foarte stabilă, există legături disulfurice în structură, iar activitatea sa nu necesită prezența cationilor divalenți, astfel încât RNaza nu este ușor denaturată și este ușor de renaturat chiar și după temperatură ridicată sau utilizarea denaturanților.RNazele sunt împărțite în endogene și exogene.RNazele endogene pot fi eliberate în același timp când celulele sunt rupte.Prin urmare, eliminarea rolului RNazelor endogene este o etapă foarte critică în procesul de extracție a ARN.RNazele exogene sunt larg distribuite.RNazele există în aer, pielea umană, părul și salivă, care sunt motive importante pentru degradarea ușoară a ARN-ului.^[3].

Interogare de date

CANS-CL02-A009 „Aplicarea Ghidurilor de acreditare a calității și competențelor în laboratorul medical în domeniul diagnosticului molecular” în cerințele tehnice propune ca standardele adecvate de calitate a apei să fie formulate conform aplicației;Recipiente etanșe de unică folosință:

RNază/Clasificare

(1) RNază A

Ribonucleaza A (RNaza A), derivată din pancreasul bovin, este o endoribonuclează care poate ataca în mod specific capătul 3′ al resturilor de pirimidină de pe ARN, tăind citozina sau uracilul format din nucleotidele adiacente.Legătura fosfodiesterică, produsul final al reacției este o nucleotidă pirimidină 3′ și o oligonucleotidă cu o nucleotidă pirimidină 3′ la sfârșit.

(2) RNază T1

Ribonucleaza T1 (RNaza T1) este derivată din Aspergillus orjzae, acționează în mod specific asupra fosfatului 3′-terminal al guaninei, iar locul de clivaj este între fosfatul 3′ al guaninei și hidroxilul 5′ al nucleotidelor adiacente.Produsul final al reacției este acid 3′guanilic și fragmente de oligonucleotide cu acid 3′guanilic la sfârșit.

(3) RNază H

Ribonucleaza H (RNaza H) a fost descoperită pentru prima dată din țesutul timusului de vițel, iar gena sa care codifică a fost donată în Escherichia coli.Poate degrada în mod specific ADN-ul: catenele de ARN în duplexuri hibride de ARN, rezultând oligonucleotide și mononucleotide cu capete 3′-OH și 5′-monofosfat, nu poate degrada ADN-ul sau ARN-ul monocatenar sau dublu.

RNază

Funcție și utilizare

Ribonucleaza poate cataliza degradarea acidului ribonucleic (ARN) și poate fi sintetizată artificial.Unguentul medicinal este utilizat local pentru a trata traume și dureri articulare.Potrivit rapoartelor, ribonucleaza poate modifica metabolismul celulei gazdă, poate inhiba sinteza virusului, poate inhiba proliferarea virusului gripal in vitro și poate inhiba formarea virusului vaccinia și herpes la embrionii de pui.Utilizarea clinică a ribonucleazei injecție intramusculară zilnică de 180 mg, benefică pentru tratamentul encefalitei epidemice, ribonucleaza poate cataliza degradarea acidului ribonucleic (ARN) și poate fi acum sintetizată artificial.Unguentul medicinal este utilizat local pentru a trata traume și dureri articulare.Potrivit rapoartelor, ribonucleaza poate modifica metabolismul celulei gazdă, poate inhiba sinteza virusului, poate inhiba proliferarea virusului gripal in vitro și poate inhiba formarea virusului vaccinia și herpes la embrionii de pui.Utilizarea clinică a injecției intramusculare zilnice de ribonuclează de 180 mg este benefică pentru tratamentul encefalitei epidemice.

RNază

Definiția inhibitorului

Definiția unității inhibitoare de RNază: cantitatea de enzimă necesară pentru a inhiba 50% din activitatea 5ng RNază A este o unitate.

Cum funcționează inhibitorii de RNază

Izotiocianat de guanidină:

Izotiocianatul de guanidină este un compus organic cu formula moleculară C2H6N4S.Utilizat în principal în medicina biologică, reactivi chimici, etc. Izotiocianatul de guanidină este un agent de lizare a proteinelor și este adesea folosit ca componentă principală a soluției de liză în reactivii de diagnostic molecular.Poate liza țesutul, distruge structura celulară și poate disocia acidul nucleic de nucleoproteină și are o denaturare puternică la RNază.Este cel mai eficient inhibitor de RNază în prezent.

TRIzol este un nou reactiv de extracție a ARN total care poate extrage direct ARN total din celule sau țesuturi.Conține substanțe precum fenolul și izotiocianatul de guanidină, care pot perturba rapid celulele și pot inhiba nucleazele eliberate de celule.

(Cu toate acestea, izotiocianatul de guanidină este periculos pentru sănătatea cercetătorilor de laborator.)

RNasin:

Glicoproteină acidă extrasă din ficat de șobolan sau blastodermă umană.Rnasin este un inhibitor necompetitiv al RNazei, care se poate lega de diferite RNaze pentru a le inactiva.

(Mai multe detalii: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Htemperatura ridicata:

Temperatura ridicată este, de asemenea, un mijloc comun de denaturare a proteinelor.

Dietilpirocarbonat (DEPC):

DEPC este un inhibitor de RNază puternic, dar incomplet, care poate inhiba activitatea RNazei prin combinarea cu inelul de aminoacizi imidazol al grupului activ de RNază pentru a denatura proteinele.

Complexul ribonucleozidic de vanadil:

Un complex format din ioni de oxid de vanadiu și nucleozide, care se leagă de RNază sub formă de substanțe de tranziție, care pot inhiba aproape complet activitatea RNazei.

alte:

SDS, ureea, pământul de diatomee etc. au, de asemenea, un anumit efect inhibitor asupra RNazei.

Evaluări ale experților

Tehnician șef Li Yujie

Director al Departamentului de Laborator, Spitalul Jiaozhou, Spitalul Dongfang afiliat Universității Tongji

Pentru a preveni biodegradarea RNazei exogene, măștile, mănușile și pălăriile trebuie purtate și înlocuite frecvent în timpul procesului de extracție a ARN.Toate articolele din sticlă trebuie coapte într-un cuptor de uscare la 200°C timp de mai mult de 2 ore.Materialele folosite pentru coacere, cum ar fi plasticul, trebuie tratate cu apă DEPC și apoi spălate cu apă distilată.Reactivii sau dispozitivele utilizate pentru extracția, conservarea și identificarea ARN-ului ar trebui să fie dedicate ARN-ului și trebuie creată o zonă independentă de operare a ARN-ului.

referinte:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, și colab.Bacteriile și virusurile din rinofaringe imediat înainte de debutul infecțiilor respiratorii inferioare acute la copiii indigeni australieni[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Filiala pentru controlul infecțiilor în spitale a Asociației Chineze de Medicină Preventivă.Ghid pentru colectarea și inspecția probelor microbiene clinice [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] „Volumul testului de biologie moleculară a testului clinic Zece mii de ce”