PCR directă este o reacție care utilizează direct țesuturi animale sau vegetale pentru amplificare fără extracția acidului nucleic.În multe feluri, PCR direct funcționează ca PCR obișnuit

Principala diferență este tamponul personalizat utilizat în PCR directă, proba poate fi supusă direct reacției PCR fără extracție de acid nucleic, dar există cerințe corespunzătoare pentru toleranța enzimelor și compatibilitatea tamponului implicat în reacția PCR directă.

Deși există mai mulți sau mai puțini inhibitori PCR în probele obișnuite, PCR directă poate realiza totuși o amplificare sigură sub acțiunea enzimelor și a tampoanelor.Reacția PCR tradițională necesită acid nucleic de înaltă calitate ca șablon, care poate inhiba progresul lin al reacției PCR dacă șablonul conține proteine ​​și alte impurități.PCR directă este în prezent una dintre cele mai populare tehnologii în domeniul diagnosticului molecular.

01 Direct PCR a fost utilizat inițial pentru animale și plante

Cea mai timpurie aplicare a PCR directă este în domeniul animalelor și plantelor, cum ar fi sângele, țesutul și părul șobolanului, pisicii, puiului, iepurilor, oilor, bovinelor etc., frunzelor și semințelor de plante etc., utilizate pentru studiul genotipării, transgenicului, detectarea plasmidelor, analiza genelor knockout, identificarea sursei ADN, analiza speciilor și alte domenii de identificare SNP.

Aceste câmpuri au unele caracteristici comune, adică conținutul genei țintă este relativ mare, iar extracția acidului nucleic este supărătoare, astfel încât PCR directă nu numai că poate economisi timp și are un impact mic asupra rezultatelor, dar și costuri.

PCR directă utilizată pentru detectarea agenților patogeni este o chestiune din ultimii ani, unii producători de reactivi PCR au făcut multe eforturi în această direcție atunci când au făcut inovații.În special în această epidemie de COVID-19, multe astfel de produse de detectare au apărut pe piață, cum ar fi Kitul de detectare a acidului nucleic SARS-CoV-2 (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) cercetat și dezvoltat de Foregene, care utilizează tehnologia Real-time RT PCR (rRT-PCR) pentru detectarea calitativă a probelor nazale sau a probelor nazale-cofanice umane SARS-CoV-2. s.

Foregene este una dintre companiile care utilizează tehnologia Direct PCR, pentru detectarea normală a ORF1ab, N, E șivariantă filiații acizi nucleici în probele de tampon nazofaringian sau orofaringian uman, cum ar fi filiația SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), filiația B.1.351 (ZA), filiația B.1.617 (IND) și filiația P.1 (BR).

02  Reactivi necesari pentru PCR direct

Probă de lizat

Eșantionul de lizat poate fi configurat singur sau achiziționat.Diferența în compoziția diferitelor mărci de lizat va face ca capacitatea de lizare să fie diferită, iar apoi timpul de lizare va fi ușor diferit.De exemplu, pentru prepararea probelor de țesut animal, se recomandă în general 30 de minute sau liza peste noapte, iar soluția de liză pentru viruși variază între 3-10 minute.

PCR master mix

Se recomandă utilizarea ADN polimerazei cu pornire la cald pentru a îmbunătăți amplificarea specifică și pentru a crește capacitatea de amplificare.Miezul PCR direct este o polimerază foarte tolerantă.

Eliminați sau inhibați componentele din probă care afectează amplificarea ADN-ului

După ce proba este procesată cu lizat, vor fi eliberate proteine, lipide și alte resturi celulare, aceste substanțe vor inhiba reacția PCR.Prin urmare, PCR directă necesită adăugarea de eliminare sau inhibitori corespunzători pentru a reduce influența acestor factori.

03  O colecție de cinci puncte de cunoaștere a PCR direct

În primul rând, tehnologia PCR directă este o tehnologie PCR directă pentru diferite probe biologice.În această condiție tehnică, nu este nevoie să se separe și să extragă acidul nucleic, să folosești direct proba de țesut ca obiect și să adaugi primerii genei țintă pentru a efectua reacția PCR.

În al doilea rând, tehnologia Direct PCR nu este doar o tehnologie tradițională de amplificare a șablonului ADN, ci include și PCR cu transcripție inversă șablon ARN.

În al treilea rând, tehnologia Direct PCR nu numai că realizează direct reacții PCR calitative de rutină pe probe de țesut, dar include și reacții qPCR în timp real, care necesită ca sistemul de reacție să aibă o capacitate puternică de interferență a fluorescenței anti-fond și a stinge fluorescența endogenă capacitatea antagonistă.

În al patrulea rând, probele vizate de tehnologia Direct PCR au nevoie doar de eliberarea de șabloane de acid nucleic și nu îndepărtează proteinele, polizaharidele, ionii de sare etc. care interferează cu reacția PCR.Ceea ce necesită polimeraza acidului nucleic și amestecul PCR din sistemul de reacție să aibă rezistență și adaptabilitate excelente pentru a asigura activitatea enzimatică și acuratețea replicării în condiții complexe.

În al cincilea rând, proba de țesut vizată de tehnologia Direct PCR fără niciun tratament de îmbogățire cu acid nucleic și cantitatea de șablon este foarte mică, ceea ce necesită ca sistemul de reacție să aibă o sensibilitate și o eficiență de amplificare extrem de ridicate.