Pierderea auzului (HL) este cea mai frecventă boală cu dizabilități senzoriale la om.În țările dezvoltate, aproximativ 80% din cazurile de surditate prelinguală la copii sunt cauzate de factori genetici.Cele mai frecvente sunt defecte cu o singură genă (așa cum se arată în Fig. 1), 124 de mutații ale genelor s-au dovedit a fi asociate cu pierderea auzului non-sindromică la oameni, restul sunt cauzate de factori de mediu.Un implant cohlear (un dispozitiv electronic plasat în urechea internă care asigură stimularea electrică direct nervului auditiv) este de departe cea mai eficientă opțiune pentru tratarea LH severă, în timp ce un aparat auditiv (un dispozitiv electronic extern care convertește și amplifică undele sonore) poate ajuta Pacienții cu LH moderată.Cu toate acestea, în prezent nu există medicamente disponibile pentru a trata HL ereditar (GHL).În ultimii ani, terapia genică a primit o atenție din ce în ce mai mare ca o abordare promițătoare pentru tratarea disfuncției urechii interne.

Fig1.Distribuția tipului de variație asociată surdității.[1]

Recent, oamenii de știință de la Institutul Salk și de la Universitatea din Sheffield au publicat un rezultat al cercetării în Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], care a arătat perspective largi de aplicare pentru terapia genică in vivo a surdității ereditare.Uri Manor, profesor asistent de cercetare la Institutul Salk și director al Centrului Waitt pentru Biofotonică Avansată, a spus că s-a născut cu o pierdere severă a auzului și a simțit că restabilirea auzului ar fi un cadou minunat.Cercetările sale anterioare au descoperit că Eps8 este o proteină de reglementare a actinei cu activități de legare și limitare a actinei;în celulele părului cohlear, complexul proteic format din Eps8 cu MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 și GNAI3 există în principal în cele mai. Vârfurile stereocililor lungi, care împreună cu MYO15A localizează BAIAP2L2 la vârfurile stereocililor mai scurte, sunt necesare pentru menținerea fasciculelor de păr.Prin urmare, Eps8 poate regla lungimea stereocililor celulelor capilare, care este esențială pentru funcția normală a auzului;Ștergerea sau mutația Eps8 va duce la stereocilie scurte, care îl fac incapabil să convertească corect sunetul în semnale electrice pentru percepția creierului, ceea ce, la rândul său, duce la surditate..În același timp, colaboratorul Walter Marcotti, profesor la Universitatea din Sheffield, a descoperit că celulele părului nu se pot dezvolta normal în absența Eps8.În acest studiu, Manor și Marcotti au făcut echipă pentru a investiga dacă adăugarea Eps8 la celulele stereociliare le-ar putea restabili funcția și, la rândul său, ar putea îmbunătăți auzul la șoareci.Echipa de cercetare a folosit vectorul virusului adeno-asociat (AAV) Anc80L65 pentru a livra secvența de codare care conține EPS8 de tip sălbatic în cohleea șoarecilor P1-P2 nou-născuți Eps8-/- prin injecție cu membrană rotundă;în celulele părului cohlear de șoarece Funcția stereocililor a fost reparată înainte ca acestea să se maturizeze;iar efectul de reparare a fost caracterizat prin tehnologia imagistică și măsurarea stereocililor.Rezultatele au arătat că Eps8 a crescut lungimea stereocililor și a restabilit funcția celulelor de păr în celulele cu frecvență joasă.De asemenea, au descoperit că, în timp, celulele păreau să-și piardă capacitatea de a fi salvate prin această terapie genică.Implicația este că acest tratament poate fi necesar să fie administrat in utero, deoarece celulele de păr Eps8-/- s-ar putea să se fi maturizat sau să fi acumulat daune nereparabile după ce șoarecii s-au născut.„Eps8 este o proteină cu multe funcții diferite și încă mai sunt multe de explorat”, a spus Manor.Cercetările viitoare vor include investigarea efectului terapiei genice Eps8 în restabilirea auzului în diferite stadii de dezvoltare și dacă ar putea fi posibilă prelungirea oportunităților de tratament.Întâmplător, în noiembrie 2020, profesorul KarenB Avraham de la Universitatea Tel Aviv din Israel și-a publicat rezultatele în revista EMBO Molecular Medicine [3], folosind o tehnologie inovatoare de terapie genetică pentru a crea un virus sintetic adeno-asociat inofensiv AAV9-PHP.B, Defectul genei din celulele de păr ale șoarecilor Syne4-/- a fost reparat prin injectarea unui virus care poartă secvența de codificare a Syne4 în urechea internă a șoarecilor, permițându-i să intre în celulele părului și să elibereze materialul genetic transportat, permițându-le să se maturizeze și să funcționeze normal (ca în Fig. 2).

Fig2.Reprezentare schematică a anatomiei urechii interne, cu accent pe organul lui Corti și funcția celulară a nesprin-4.

Se poate observa că utilizarea terapiei genice pentru atingerea scopului de tratare a bolilor ereditare la nivel de genă prin inserarea, îndepărtarea sau corectarea oricăror gene mutante pentru tratament (adică controlul modificărilor genetice ale bolii) are un efect clinic ridicat.perspective de aplicare.Metodele actuale de terapie genetică pentru surditatea cu deficit genetic pot fi împărțite în următoarele categorii:

înlocuirea genelor

Înlocuirea genelor este, fără îndoială, cea mai „directă” formă de terapie genetică, bazată pe identificarea și înlocuirea unei gene defecte cu o copie normală sau de tip sălbatic a genei.Primul studiu de succes de terapie genetică a urechii interne pentru pierderea auzului cauzată de ștergerea genei veziculare a transportorului de glutamat 3 (VGLUT3);Livrarea mediată de AAV1 a supraexpresiei exogene a VGLUT3 în celulele părului urechii interne (IHCs) Poate duce la recuperarea susținută a auzului, recuperarea parțială a morfologiei sinaptice a panglicii și răspunsurile convulsive [4].Cu toate acestea, în exemplele care includ cele două înlocuiri de gene furnizate de AAV descrise în introducerea de mai sus, este important de reținut că modelele de șoarece utilizate pentru anumite tipuri de tulburări ereditare de pierdere a auzului cu ștergere a genelor sunt temporal diferite de oameni, iar la șoarecii P1, urechea internă se află în stadiul matur de dezvoltare.În schimb, oamenii se nasc cu o ureche interioară matură.Această diferență previne aplicarea posibilă a rezultatelor șoarecelui în tratamentul tulburărilor ereditare de surditate umană, cu excepția cazului în care terapia genică este administrată la urechile mature de șoarece.

Editare genetică: CRISPR/Cas9

În comparație cu „înlocuirea genelor”, dezvoltarea tehnologiei de editare a genelor a adus zorii tratării bolilor genetice de la rădăcină.Este important că metoda de editare a genelor compensează deficiențele metodelor tradiționale de terapie genetică cu supraexpresie care nu sunt potrivite pentru bolile ereditare dominante de surditate și problema că metoda supraexpresiei nu durează mult.După ce cercetătorii chinezi au eliminat în mod specific alela mutantă Myo6C442Y la șoarecii Myo6WT/C442Y utilizând sistemul de editare a genei AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2 și în decurs de 5 luni de la knockout, șoarecii Funcția auditivă a modelului a fost restabilită;în același timp, s-a mai observat că rata de supraviețuire a celulelor de păr din urechea internă a fost îmbunătățită, forma cililor a devenit regulată, iar indicatorii electrofiziologici au fost corectați [5].Acesta este primul studiu din lume care utilizează tehnologia CRISPR/Cas9 pentru tratamentul surdității ereditare cauzată de mutația genei Myo6 și este un progres important în cercetarea tehnologiei de editare a genelor pentru tratamentul surdității ereditare.Traducerea clinică a tratamentului oferă o bază științifică solidă.

Metode de livrare a terapiei genice

Pentru ca terapia genică să aibă succes, moleculele de ADN nu pot pătrunde eficient în celule datorită hidrofilității și încărcării negative a grupelor fosfat și pentru a asigura integritatea moleculelor de acid nucleic suplimentate, trebuie selectată o metodă sigură și eficientă.ADN-ul suplimentat este livrat celulei sau țesutului țintă.AAV este utilizat pe scară largă ca vehicul de livrare pentru tratamentul bolii datorită efectului său infecțios ridicat, imunogenității scăzute și tropismului larg pentru diferite tipuri de țesuturi.În prezent, o mare parte de lucrări de cercetare a determinat tropismul diferitelor subtipuri de AAV în raport cu diferite tipuri de celule din cohleea șoarecelui.Folosirea caracteristicilor de livrare AAV combinate cu promotori specifici celulei poate obține expresia specifică celulei, ceea ce poate reduce efectele în afara țintei.În plus, ca alternativă la vectorii AAV tradiționali, noi vectori AAV sintetici sunt în curs de dezvoltare și prezintă o capacitate de transducție superioară în urechea internă, dintre care AAV2/Anc80L65 este cel mai utilizat.Metodele de livrare non-virale pot fi împărțite în continuare în metode fizice (microinjecție și electroporare) și metode chimice (pe bază de lipide, pe bază de polimeri și nanoparticule de aur).Ambele abordări au fost utilizate în tratamentul tulburărilor ereditare de surditate și au arătat diferite avantaje și limitări.În plus față de vehiculul de livrare pentru terapia genică ca vehicul, pot fi utilizate diferite abordări pentru administrarea genei in vivo pe baza diferitelor tipuri de celule țintă, căi de administrare și eficacitate terapeutică.Structura complicată a urechii interne face dificilă atingerea celulelor țintă, iar distribuția agenților de editare a genomului este lentă.Labirintul membranos este situat în labirintul osos al osului temporal și include ductul cohlear, ductul semicircular, utriculul și balonul.Izolarea sa relativă, circulația limfatică minimă și separarea de sânge printr-o barieră de labirint de sânge limitează livrarea sistemică eficientă a medicamentelor numai la șoarecii nou-născuți.Pentru a obține titruri virale adecvate pentru terapia genică, este necesară injectarea locală directă a vectorilor virali în urechea internă.Căile stabilite de injectare includ [6]: (1) membrană fereastră rotundă (RWM), (2) traheostomie, (3) cohleostomie endolimfatică sau perilimfatică, (4) membrană fereastră rotundă plus fenestrarea tubului (CF) (ca în Fig. 3).

Fig3.Livrarea urechii interne a terapiei genice.

Deși s-au făcut multe progrese în terapia genică, bazate pe obiective translaționale clinice, trebuie făcută mai multă muncă înainte ca terapia genică să devină o opțiune de tratament de primă linie pentru pacienții cu boli genetice, în special în dezvoltarea de vectori și metode de livrare sigure și eficiente.Dar credem că, în viitorul apropiat, aceste tipuri de tratamente vor deveni un element de bază al terapiei personalizate și vor avea un impact extrem de pozitiv asupra vieții persoanelor cu tulburări genetice și a familiilor acestora.

Foregene a lansat, de asemenea, un kit de screening de mare randament pentru genele vizate, care este rapid și poate efectua transcripție inversă și reacții qPCR fără extracția ARN.

Link-uri de produse

Kit Cell Direct RT-qPCR—Taqman/SYBR GREEN I

Pentru mai multe informații despre produs, vă rugăm să contactați:

overseas@foregene.com