Real Time PCR, cunoscută și sub numele de PCR cantitativ sau qPCR, este o metodă pentru monitorizarea și analiza în timp real a produselor de amplificare PCR.
Deoarece PCR cantitativ are avantajele unei operațiuni simple, rapide și convenabile, sensibilitate ridicată, repetabilitate bună și rată scăzută de contaminare, este utilizat pe scară largă în teste medicale, evaluarea eficacității medicamentelor, cercetarea expresiei genelor, cercetarea transgenică, detectarea genelor, detectarea patogenilor, detectarea animalelor și plantelor., testarea alimentelor și alte domenii.
Prin urmare, fie că sunteți angajat în cercetare de bază în științele vieții, fie angajați ai unor companii farmaceutice, companii de creștere a animalelor, companii alimentare sau chiar angajați ai birourilor de inspecție la intrare-ieșire și carantină, departamente de monitorizare a mediului, spitale și alte unități, veți fi mai mult sau mai puțin expus sau trebuie să cunoașteți cunoștințele de stăpânire a PCR cantitativă.

Principiul PCR în timp real

Real Time PCR este o metodă prin care substanțe fluorescente sunt adăugate la sistemul de reacție PCR, iar intensitatea semnalului de fluorescență în procesul de reacție PCR este monitorizată în timp real de un instrument PCR cantitativ, iar în final datele experimentale sunt analizate și procesate.

【Curba de amplificare】este curba care descrie procesul dinamic al PCR.Curba de amplificare a PCR nu este de fapt o curbă exponențială standard, ci o curbă sigmoidă.

[Faza platformei curbei de amplificare]Odată cu creșterea numărului de cicluri PCR, inactivarea ADN polimerazei, epuizarea dNTP-urilor și a primerilor și inhibarea reacției de sinteză de către pirofosfatul de produs secundar al reacției etc., PCR nu se extinde întotdeauna exponențial., și va intra în cele din urmă pe un platou.

[Regiune de creștere exponențială a curbei de amplificare]Deși faza de platou variază foarte mult, într-o anumită regiune a regiunii de creștere exponențială a curbei de amplificare, repetabilitatea este foarte bună, ceea ce este foarte important pentru analiza cantitativă a PCR.

[Valoarea pragului și valoarea Ct]Am stabilit valoarea limită de detectare a fluorescenței la poziția corespunzătoare în zona de creștere exponențială a curbei de amplificare, și anume valoarea pragului (Pragul).Intersecția valorii prag și a curbei de amplificare este valoarea Ct, adică valoarea Ct se referă la numărul de cicluri (Threshold Cycle) când este atinsă valoarea pragului.

Graficul de mai jos arată în mod clar relația dintre linia de prag și curba de amplificare, pragul și valoarea Ct.

【Cum se cuantifică?】

Sa dovedit prin teoria matematică că valoarea Ct are o relație liniară inversă cu logaritmul numărului de șabloane inițiale.Real Time PCR monitorizează produsele de amplificare PCR în timp real și le cuantifică în timpul fazei de amplificare exponențială.

Pentru fiecare ciclu de PCR, ADN-ul a crescut exponențial de 2 ori și în curând a atins un platou.

Presupunând că cantitatea de ADN inițial este A₀ , după n cicluri, cantitatea teoretică de produs ADN poate fi exprimată ca:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Apoi, cu cât cantitatea inițială de ADN A 0 este mai mare, cu atât cantitatea de produs amplificat atinge mai repede valoarea de detecție An, iar numărul de cicluri la atingerea An este valoarea Ct.Adică, cu cât cantitatea inițială de ADN A 0 este mai mare, cu atât curba de amplificare atinge vârfurile mai devreme și, în mod corespunzător, numărul necesar de cicluri n este mai mic.

Efectuăm diluarea în gradient a standardului de concentrație cunoscută și îl folosim ca șablon pentru PCR în timp real, iar o serie de curbe de amplificare vor fi obținute la intervale egale în ordinea cantității de ADN de pornire de la mai mult la mai puțin.Conform relației liniare dintre valoarea Ct și logaritmul numărului de șabloane de pornire, a[curba standard] poate fi creată.

Prin înlocuirea valorii Ct a probei cu concentrație necunoscută în curba standard, se poate obține cantitatea inițială șablon a probei cu concentrație necunoscută, care este principiul cantitativ al PCR în timp real.

Metoda de detectare a PCR în timp real

Real Time PCR detectează produsele de amplificare PCR prin detectarea intensității fluorescenței în sistemul de reacție.

Principiul metodei de încorporare a colorantului fluorescent】

Coloranți fluorescenți, cum ar fi TB Green®, se pot lega nespecific la ADN-ul dublu catenar în sistemele PCR și se pot fluoresce la legare.

Intensitatea fluorescenței în sistemul de reacție a crescut exponențial odată cu creșterea ciclurilor PCR.Prin detectarea intensității fluorescenței, cantitatea de amplificare a ADN-ului din sistemul de reacție poate fi monitorizată în timp real, iar apoi cantitatea de șablon de pornire din probă poate fi estimată invers.

【Principiul metodei sondei fluorescente】

sondă fluorescentăeste o secvență de acid nucleic cu o grupare fluorescentă la capătul 5′ și o grupare de stingere la capătul 3′, care se poate lega în mod specific la șablon.Când sonda este intactă, fluorescența emisă de fluorofor este stinsă de grupul de stingere și nu poate avea fluorescență.Când sonda este descompusă, substanța fluorescentă se va disocia și va emite fluorescență.

La soluția de reacție PCR se adaugă o sondă fluorescentă.În timpul procesului de recoacere, sonda fluorescentă se va lega de poziția specifică a șablonului.În timpul procesului de extensie, activitatea exonucleazei 5′→3′ a enzimei PCR poate descompune sonda fluorescentă hibridizată cu șablonul, iar substanța fluorescentă este disociată pentru a emite fluorescență.Prin detectarea intensității fluorescenței sondei în sistemul de reacție, se poate atinge scopul monitorizării cantității de amplificare a produsului PCR.

【Selectarea metodei de detectare a fluorescenței】

Dacă este utilizat pentru a distinge secvențele cu omologie înaltă și pentru a efectua detecția PCR multiplex, cum ar fi analiza de tipare SNP, metoda sondei fluorescente este de neînlocuit.
Pentru alte experimente PCR în timp real, poate fi utilizată o metodă himeră fluorescentă simplă, ușoară și ieftină.

sonde Specificitate puternică, capabilă de PCR multiplex

Neajuns

Cerințe de înaltă specificitate pentru amplificare;

PCR multiplex nu poate fi efectuatăNevoie de proiectare a unor sonde specifice, cost ridicat;

uneori proiectarea sondei este dificilă

Produse asemanatoare: