PCR, multiplu PCR, PCR in situ, PCR inversă, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Vom sorta conceptele, pașii și detaliile diferitelor PCR

Ⅰ. PCR

Reacția în lanț a polimerazei, denumită PCR, este o tehnologie biologică moleculară care este utilizată pentru a mări anumite fragmente de ADN.Poate fi privit ca o replicare specială a ADN-ului in vitro.ADN-polimeraza (ADN-polimeraza I) a fost descoperită încă din 1955, iar Fragmentul Klenow de E. Coli, care are valoare experimentală și caracter practic, a fost descoperit de Dr. H. Klenow la începutul anilor 1970, dar pentru că această enzimă nu tolerează temperatura, temperatura ridicată o poate degenera, astfel încât să nu întâlnească degenerarea la temperatură ridicată a polimerazei.Enzimele utilizate astăzi (numite Taq polimerază), au fost izolate din Thermus aquaticus, o bacterie de izvoare termală în 1976. Caracteristica sa este că poate rezista la temperaturi ridicate și este o enzimă ideală, dar este utilizată pe scară largă după anii 1980.Conceptul original al prototipului primitiv original al PCR este similar cu repararea și copierea genelor, care a fost propus de Dr. KJell Kleppe în 1971. El a publicat prima copie a genei simplă și pe termen scurt (similar cu primele două reacții de ciclu ale PCR).PCR dezvoltat astăzi a fost dezvoltat de Dr. Kary B. Mullis în 1983. Dr. Mullis a servit companii de PE în acel an, astfel încât PE are un statut special în industria PCR.Dr. Mullis a publicat oficial prima lucrare înrudită cu Saiki și alții în 1985. De atunci, utilizarea PCR este de mii de kilometri pe zi, iar calitatea lucrărilor conexe poate face ca multe alte metode de cercetare să fie neplăcute.Ulterior, tehnologia PCR este utilizată pe scară largă în cercetarea științifică biologică și aplicațiile clinice, devenind cea mai importantă tehnologie a cercetării în biologie moleculară.Mullis a câștigat și Premiul Nobel pentru Chimie în 1993.

PCRPrincipiu

Principiul de bază al tehnologiei PCR este similar cu procesul natural de replicare a ADN-ului, iar specificitatea acestuia depinde de primerul oligonucleotid care este complementar ambelor capete ale secvenței țintă.PCR este compusă din degenerare-reapare-extindere a trei etape de reacții de bază: ①Degenerarea ADN-ului șablon: După ce ADN-ul șablon este încălzit la aproximativ 93°C pentru o anumită perioadă de timp, soluția de ADN dublă pentru ADN-ul cu lanț dublu format prin amplificarea PCR a ADN-ului șablon.②Recoacerea (compusul) ADN-ului șablon și a primerului: După ce ADN-ul șablon este încălzit și degenerat într-un singur lanț, temperatura scade la aproximativ 55°C.Secvența complementară a primerului și a ADN-ului șablon monocatenar.③Extensia primerului: șablon ADN-legarea primerului se bazează pe acțiunea polimerazei TaqDNA, cu dNTP ca materie primă de reacție.Păstrați principiul replicării, sintetizați un nou lanț de copiere semi-rezervat care completează lanțul de ADN șablon și repetați ciclul degenerare-recoacere-extindere trei procese pot obține mai multe „lanțuri de copie semi-rezervate”, iar acest nou lanț este disponibil din nou Deveniți un șablon pentru următorul ciclu.Este nevoie de 2-4 minute pentru a finaliza bucla, gena țintă poate fi amplificată de câteva milioane de ori în 2-3 ore.

StandardPCRSistem de reacție

Cinci elemente ale reacției PCR

Există în principal cinci tipuri de substanțe implicate în reacția PCR, și anume primer, enzimă, dNTP, șablon și tampon (este necesar Mg2+).[procedura PCR]

Procesul PCR standard este împărțit în trei etape

1. Degenerarea ADN-ului (90°C-96°C): Șabloane ADN cu lanț dublu sub acțiune termică, legăturile de hidrogen se rup, formând un ADN cu un singur lanț.

2. Recoacere (25℃ -65℃): temperatura sistemului este redusă, primerul este combinat cu șablonul ADN pentru a forma un lanț dublu local.

3. Extensie (70℃ -75℃): Sub acțiunea enzimei Taq (aproximativ 72°C, cea mai bună activitate), dNTP este utilizat ca materie primă, se extinde de la capătul 5′ al primerului → capătul 3′, sinteza și șablonul se completează reciproc lanțul de ADN.

Fiecare ciclu este denaturat, recoapt și extins, dublând conținutul de ADN.In prezent, datorita zonei scurte de amplificare, unele PCR pot fi replicate intr-un timp foarte scurt chiar daca activitatea enzimei Taq nu este optima, deci poate fi schimbata in doua etape, adica recoacerea si extensia pot fi efectuate la 60°C-65°C in acelasi timp.Pentru a reduce procesul de ridicare și răcire și pentru a îmbunătăți viteza de răspuns.

Caracteristicile reacției PCR

● Specificitate ridicată

Factorii determinanți specifici ai răspunsului PCR sunt: ​​①Combinația specifică a primerului și ADN-ului șablon.②Principiul împerecherii bazelor.③Fidelitatea reacției de sinteză a polimerazei TaqDNA.④ Specificitatea și conservativitatea genei țintă.

Combinația corectă de grunduri și șabloane este cheia.Legarea primerului și a șablonului și extinderea lanțului de primer se bazează pe principiul potrivirii bazelor alcaline.Loialitatea reacțiilor de sinteză a polimerazei și rezistența la temperatură ridicată a ADN polimerazei Taq pentru a face legarea (compusul) șablonului și primerului în reacție pot fi realizate la o temperatură mai mare.Specificitatea combinației este mult crescută.Clipul poate menține un grad ridicat de corectitudine.Prin selectarea unei regiuni genetice țintă cu conservativitate ridicată și conservativitate ridicată, specificitatea acesteia este mai mare.

● Sensibilitate ridicată

Volumul de producție al produselor PCR este crescut prin indice, care poate extinde șablonul de pornire al lui Picker (PG=10-12) pentru a crește nivelul microcontrolerului la nivelul de micrograme (μg= -6).Celulele țintă pot fi detectate de la 1 milion de celule;în detectarea virușilor, sensibilitatea PCR poate ajunge la 3 RFU-uri (unități formate pete goale);rata minimă de detecție în știința bacteriană este de 3 bacterii.

● Simplu și rapid

Reflexia PCR folosește o ADN polimerază Taq la temperatură înaltă, care adaugă soluția de reacție la un moment dat, adică o reacție de degenerare-recoacere-extensie pe soluția de amplificare a ADN-ului și vasul de baie de apă.În general, reacția de amplificare este finalizată în 2 până la 4 ore.Produsele crescute sunt, în general, analizate prin sabie electrică și nu trebuie să utilizeze izotopi, fără poluare radioactivă și promovare ușoară.

● Puritatea specimenului este scăzută

Nu este nevoie să se separe virușii sau bacteriile și celulele de cultură.Produsele ADN brute și ARN-ul pot fi utilizate ca amplificatoare.Detectarea amplificării ADN-ului poate fi utilizată direct folosind probe clinice, cum ar fi sânge, lichid corporal, lichid de spălat pentru tuse, păr, celule și țesut viu.

PCRprobleme comune

● Fals negativ, fără benzi amplificate

Etapele cheie ale reacției PCR includ: ① prepararea acizilor nucleici șablon, ② calitatea și specificitatea primerilor, ③ calitatea enzimelor ④ condițiile ciclului PCR.Găsirea motivului ar trebui, de asemenea, analizată și studiată pentru link-urile de mai sus.

Șabloane: ① Șablonul conține proteine ​​diverse, ② Șablonul conține un inhibitor al enzimei Taq, ③ Proteina din șablon nu este eliminată, în special proteina de grup din cromozom.⑤ degenerarea acidului nucleic deminare nu este completă.Când calitatea enzimelor și primerilor este bună, nu există o bandă de amplificare, care este cel mai probabil tratamentul digestiv al specimenelor.Există ceva în neregulă cu procesul de extracție a acidului nucleic șablon, așa că pentru a pregăti o soluție de digestie eficientă și stabilă, procedura acesteia ar trebui să fie fixată și nu schimbată în mod arbitrar.

Inactivarea enzimei: o enzimă nouă sau ambele enzime vechi și noi ar trebui utilizate împreună pentru a analiza dacă activitatea enzimatică este pierdută sau insuficientă, ceea ce duce la fals negative.Trebuie menționat că enzima Taq sau bromura de etidio sunt uneori uitate.

Primer: calitatea grundului, concentrația grundului și dacă concentrația celor doi primeri este simetrică.Este un motiv comun pentru eșecul PCR sau banda în creștere nu este ideală și predispusă la difuzie.Există probleme cu calitatea primerilor unor numere de lot.Cei doi primeri au o concentrație mare și o concentrație scăzută, determinând o amplificare asimetrică cu eficiență scăzută.Contramăsurile sunt: ​​① Selectați un primer bun pentru a sintetiza unitățile.② Concentrația grundului nu depinde numai de valoarea OD, ci acordă și atenție lichidului original al grundului pentru a face electroforeza pe gel de zahăr cu agar.Trebuie să existe o zonă de bandă de grund, iar luminozitatea celor două grunduri ar trebui să fie în general consistentă.Belt, PCR poate eșua în acest moment și ar trebui rezolvată cu unitatea de sinteză a primerului.Dacă un primer este mare, luminozitatea este scăzută, iar concentrația sa trebuie echilibrată atunci când este diluat.③ Grundul trebuie plătit și depozitat la o concentrație mare pentru a preveni înghețarea multiple sau părțile frigorifice pe termen lung ale frigiderului, ceea ce va determina deteriorarea și degradarea amorsei.④ Designul grundului este nerezonabil, cum ar fi lungimea grundului este insuficientă, iar între grunduri se formează di cluster.

Concentrația Mg2+: concentrația Mg2+ion are un impact mare asupra eficienței amplificării PCR.Concentrarea excesivă poate reduce sexul opus al amplificării PCR.Dacă concentrația este prea scăzută, ieșirea de amplificare PCR va face chiar eșecul amplificarii PCR fără banda de expansiune.

Modificarea volumului de reacție: Volumul utilizat în amplificarea PCR este de 20ul, 30ul și 50ul sau 100ul, volumul mare al aplicației pentru amplificarea PCR este stabilit în funcție de diferite scopuri ale cercetării științifice și testării clinice.După ce faceți volume mici, cum ar fi 20ul, este necesar să faceți o stare a cordonului atunci când faceți dimensiunea, altfel va eșua.

Motive fizice: Transformarea este foarte importantă pentru amplificarea PCR.Dacă temperatura de degenerare este scăzută, timpul de degenerare este scurt, este probabil să apară în fals negative;temperatura de recoacere prea scăzută poate provoca amplificare nespecifică și poate reduce eficiența specifică de amplificare.Afectează foarte mult combinația de primeri și șabloane pentru a reduce eficiența amplificării PCR.Uneori este necesar să se utilizeze termometre standard pentru a detecta variabilitatea, recoacerea și temperatura extinsă în aragazul extensibil sau solubil în apă, care este unul dintre motivele eșecului PCR.

Variante de secvență țintă: Dacă apare secvența țintă, o mutație sau deleție, combinația dintre prototip și șablon este combinată, sau din cauza lipsei unei secvențe țintă, primerul și șablonul vor pierde secvența complementară, iar amplificarea lui PCR nu va avea succes.

● Fals pozitiv

Banda de amplificare PCR pare în concordanță cu banda secvenței țintă și uneori banda sa este mai îngrijită și mai înaltă.

Designul primerului nu este adecvat: secvența de amplificare selectată și secvența de amplificare fără scop au omoloage, astfel încât atunci când amplificarea PCR, produsele PCR amplificate sunt secvențe neinteligente.Secvența țintă este prea scurtă sau primerul este prea scurt și este predispusă la fals pozitiv.Trebuie reproiectat.

Poluarea încrucișată a secvenței țintă sau a produselor de amplificare: Există două motive pentru această poluare: În primul rând, poluarea încrucișată a întregului genom sau a segmentelor mari, care duce la fals pozitive.Acest tip de fals pozitiv poate fi rezolvat prin următoarele metode: Fiți atenți și blând în timpul funcționării pentru a preveni inhalarea secvenței țintă în pistolul de probă sau stropirea din tubul centrifugal.Cu excepția enzimelor și substanțelor care nu pot rezista la temperaturi ridicate, toți reactivii sau echipamentele trebuie dezinfectate cu presiune ridicată.Țevile centrifugale și mostrele trebuie utilizate odată.Când este necesar, înainte de adăugarea probelor, tubul de reacție și reactivul sunt expuse la razele ultraviolete pentru a distruge acidul nucleic existent.În al doilea rând, mici fragmente în poluarea aerului.Aceste fragmente mici sunt mai scurte decât secvența țintă, dar au o anumită omologie.Poate fi îmbinat unul cu celălalt.După completarea primerilor, produsul PCR poate fi extins, ceea ce va determina producția de fals pozitiv.Poate fi folosit pentru a reduce sau elimina metoda de PCR cuib.

● Apare banda de amplificare nespecifica

Benzile care au apărut după amplificarea PCR sunt inconsistente cu dimensiunea așteptată, sau mari sau mici, sau în același timp, sau în același timp, benzi de amplificare specifice și benzi de amplificare nespecifice.Apariția benzilor nespecifice este: În primul rând, primerii sunt complementari incompleti cu secvența țintă sau polimerizarea primerului pentru a forma un di cluster.Al doilea este că concentrația de ioni MG2+ este prea mare, temperatura de recoacere este prea scăzută și numărul de cicluri PCR este legat.În al doilea rând, calitatea și cantitatea de enzime.Adesea, enzimele unor surse sunt predispuse la benzi nespeciale, iar enzimele celeilalte surse nu apar.Uneori apare și amplificarea nespecifică a enzimelor.Contramăsurile sunt: ​​atractive reproiectate dacă este necesar.Reduceți cantitatea de enzimă sau înlocuiți enzima din altă sursă.Reduceți cantitatea de primare, creșteți cantitatea de șabloane în mod corespunzător și reduceți numărul de cicluri.Creșteți în mod corespunzător temperatura de recoacere sau utilizați metoda cu două puncte de temperatură (degenerare de 93°C, recoacere și extindere la aproximativ 65°C).

● Apare câlți fulgizi sau bandă de pete

Amplificarea PCR pare uneori a fi aplicată sau decojită sau centură asemănătoare covorului.Din acest motiv, din cauza cantității excesive de enzime sau a calității proaste a enzimei, concentrația de dNTP este prea mare, concentrația de Mg2+ este prea mare, temperatura de recoacere este prea scăzută și numărul de cicluri este prea mare.Contramăsurile sunt: ​​①Reduceți cantitatea de enzime sau schimbați enzima din altă sursă.②Reduceți concentrația de dNTP ③Reduceți în mod corespunzător concentrația de Mg2+.④Măriți cantitatea de șabloane și reduceți numărul de cicluri.

produse asemanatoare

PCR Heroᵀᴹ (cu colorant)

◮ Fidelitate mai mare: de 6 ori mai mare decât enzima Taq obișnuită;

◮ Viteză de amplificare mai mare

◮ Mai multă adaptabilitate a șablonului

◮ Eficiență mai mare de amplificare

◮ Toleranța la mediu este mai puternică: plasat la 37°C timp de o săptămână, menținând mai mult de 90% activitate;

◮ Are activitate ADN polimerază 5’→3’ și activitate exonuclează 5’→3’, fără activitate exonuclează 3’→5’.

PCR Easyᵀᴹ (cu colorant)

Sistemul de reacție unic și Taq DNA Polymerase de înaltă eficiență fac ca reacția PCR să aibă o eficiență, specificitate și sensibilitate mai mari de amplificare.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Kitul într-un singur pas face transcripția inversă și qPCR două reacții în același tub, trebuie doar să adăugați ARN șablon, primeri specifici PCR și ddH fără RNază₂O.

◮ Kitul poate analiza rapid și eficient cantitativ ARN viral sau urme de ARN.

◮ Kitul folosește un reactiv unic de transcripție inversă Foregene și Foregene HotStar Taq DNA Polymerase combinate cu un sistem de reacție unic pentru a îmbunătăți eficient eficiența amplificării și specificitatea reacției.

◮ Sistemul de reacție optimizat face ca reacția să aibă o sensibilitate de detecție mai mare, o stabilitate termică mai puternică și o toleranță mai bună.

◮ RT-qPCR Ușor^TM(One Step) - Kitul SYBR Green I vine cu colorant de referință intern ROX, care poate fi utilizat pentru a elimina fundalul semnalului și erorile de semnal între godeuri, ceea ce este convenabil de utilizat pentru clienți în diferite modele de instrumente PCR cantitative.

RT Ușor^TMII (Master Premix pentru sinteza cADN-ului prima catenă pentruPCR în timp real)

- Capacitate eficientă de a elimina gDNA, care poate elimina gDNA din șablon în decurs de 2 minute.

- Sistem eficient de transcripție inversă, durează doar 15 minute pentru a finaliza sinteza primei catene de ADNc.

-Șabloane complexe: șabloanele cu conținut ridicat de GC și structură secundară complexă pot fi, de asemenea, inversate cu eficiență ridicată.

-Sistem de transcripție inversă de înaltă sensibilitate, șabloanele la nivel pg pot obține, de asemenea, ADNc de înaltă calitate.

-Sistemul de transcripție inversă are stabilitate termică ridicată, temperatura optimă de reacție este de 42℃ și are încă o performanță bună de transcriere inversă la 50℃.