PCR (reacția în lanț a polimerazei) este una dintre tehnologiile de amplificare a ADN-ului in vitro, cu o istorie de peste 30 de ani.

Tehnologia PCR a fost introdusă de Kary Mullis din Cetus, SUA în 1983. Mullis a solicitat un brevet PCR în 1985 și a publicat prima lucrare academică PCR despre Știință în același an.Mullis a primit Premiul Nobel pentru chimie în 1993 pentru munca sa.

Principiile de bază ale PCR

PCR poate amplifica fragmentele de ADN țintă de peste un milion de ori.Principiul se află sub cataliza ADN polimerazei, folosind catenul de ADN părinte ca șablon și primer specific ca punct de plecare pentru extensie.Este replicat in vitro prin etape precum denaturarea, recoacere și extensie.Procesul ADN-ului catenei fiice complementar cu ADN-ul șablon al catenei părinte.

Procesul PCR standard este împărțit în trei etape:

1.Denaturare: Folosiți temperaturi ridicate pentru a separa catenele duble de ADN.Legătura de hidrogen dintre duble catena ADN este ruptă la temperatură ridicată (93-98 ℃).

2. Recoacere: După ce ADN-ul dublu catenar este separat, reduceți temperatura, astfel încât primerul să se poată lega de ADN-ul monocatenar.

3.Extensie: ADN polimeraza începe să sintetizeze catenele complementare de-a lungul catenelor de ADN de la primeri legați atunci când temperatura este scăzută.Când extinderea este finalizată, un ciclu este încheiat și numărul de fragmente de ADN se dublează

Schimbând aceste trei etape de 25-35 de ori, numărul fragmentelor de ADN va crește exponențial.

Ingeniozitatea PCR este că diferiți primeri pot fi proiectați pentru diferite gene țintă, astfel încât fragmentele genei țintă pot fi amplificate într-o perioadă scurtă de timp.

Până acum, PCR poate fi împărțită în trei categorii, și anume PCR obișnuită, PCR cantitativă fluorescentă și PCR digitală.

Prima generație de PCR obișnuit

Utilizați un instrument obișnuit de amplificare PCR pentru a amplifica gena țintă și apoi utilizați electroforeza pe gel de agaroză pentru a detecta produsul, se poate face doar analiză calitativă.

Principalele dezavantaje ale PCR de prima generație:

1.Propus la amplificare nespecifică și la rezultate fals pozitive.

2.Detecția durează mult timp și operațiunea este greoaie.

3.Se poate face doar un test calitativ

PCR în timp real de a doua generație

PCR în timp real, cunoscut și sub denumirea de qPCR, utilizează sonde fluorescente care pot indica progresul sistemului de reacție și monitorizează acumularea de produse amplificate prin acumularea de semnale fluorescente și judecă rezultatele prin curba de fluorescență.Poate fi cuantificat cu ajutorul valorii Cq și al curbei standard.

Deoarece tehnologia qPCR este realizată într-un sistem închis, probabilitatea de contaminare este redusă, iar semnalul de fluorescență poate fi monitorizat pentru detectarea cantitativă, deci este cea mai utilizată în practica clinică și a devenit tehnologia dominantă în PCR.

Substanțele fluorescente utilizate în PCR cantitativ fluorescent în timp real pot fi împărțite în: sondă fluorescentă TaqMan, balize moleculare și colorant fluorescent.

1) Sondă fluorescentă TaqMan:

În timpul amplificării PCR, se adaugă o sondă fluorescentă specifică în timp ce se adaugă o pereche de primer.Sonda este o oligonucleotidă și ambele capete sunt marcate cu o grupare fluorescentă reporter și o grupare fluorescentă de stingere.

Când sonda este intactă, semnalul fluorescent emis de grupul raportor este absorbit de grupul de stingere;în timpul amplificării PCR, activitatea exonucleazei 5′-3′ a enzimei Taq scindează și degradează sonda, făcând grupul fluorescent reporter și stingerea Grupul fluorescent este separat, astfel încât sistemul de monitorizare a fluorescenței să poată primi semnalul de fluorescență, adică de fiecare dată când o catenă de ADN este amplificată, se formează un semnal fluorescent și se sincronizează complet cu formarea fluorescentă a fluorescenței. produsul PCR.

2) Colorant fluorescent SYBR:

În sistemul de reacție PCR, se adaugă un exces de colorant fluorescent SYBR.După ce colorantul fluorescent SYBR este încorporat nespecific în dublu catena ADN, emite un semnal fluorescent.Molecula de colorant SYBR care nu este încorporată în lanț nu va emite niciun semnal fluorescent, asigurând astfel semnalul fluorescent. Creșterea produselor PCR este complet sincronizată cu creșterea produselor PCR.SYBR se leagă doar de ADN-ul dublu catenar, astfel încât curba de topire poate fi utilizată pentru a determina dacă reacția PCR este specifică.

3) Farul molecular:

Este o sondă oligonucleotidă dublu marcată cu buclă de tulpină care formează o structură în ac de păr de aproximativ 8 baze la 5 și 3 capete.Secvențele de acid nucleic de la ambele capete sunt împerecheate complementar, determinând gruparea fluorescentă și gruparea de stingere să fie strânse.Aproape, nu se va produce fluorescență.

După ce produsul PCR este generat, în timpul procesului de recoacere, partea de mijloc a farului molecular este asociată cu o secvență specifică de ADN, iar gena fluorescentă este separată de gena de stingere pentru a produce fluorescență.

Principalele dezavantaje ale PCR de a doua generație:

Sensibilitatea încă lipsește, iar detectarea exemplarelor cu copii mici este inexactă.

Există influența valorii de fundal, iar rezultatul este susceptibil de interferență.

Când există inhibitori PCR în sistemul de reacție, rezultatele detectării sunt susceptibile de interferență.

PCR digital de a treia generație

PCR digitală (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) calculează numărul de copiere al secvenței țintă prin detectarea punctului final și poate efectua o detecție cantitativă absolută precisă fără a utiliza controale interne și curbe standard.

PCR digitală utilizează detecția punctului final și nu depinde de valoarea Ct (pragul ciclului), astfel încât reacția PCR digitală este mai puțin afectată de eficiența amplificării, iar toleranța la inhibitorii de reacție PCR este îmbunătățită, cu acuratețe și reproductibilitate ridicate.

Datorită caracteristicilor de înaltă sensibilitate și precizie ridicată, nu este ușor interferat de inhibitorii de reacție PCR și poate realiza o cuantificare absolută adevărată fără produse standard, care a devenit un punct fierbinte de cercetare și aplicare.

În funcție de diferitele forme ale unității de reacție, aceasta poate fi împărțită în trei tipuri principale: sisteme microfluidice, cip și picături.

1) PCR digitală microfluidic, mdPCR:

Pe baza tehnologiei microfluidice, matrița ADN este separată.Tehnologia microfluidică poate realiza nano-upgradarea probei sau generarea de picături mai mici, dar picăturile au nevoie de o metodă specială de adsorbție și apoi combinate cu sistemul de reacție PCR.mdPCR a fost adoptat treptat prin alte metode de înlocuire.

2) PCR digitală pe bază de picături, ddPCR:

Utilizați tehnologia de generare a picăturilor de apă în ulei pentru a procesa proba în picături și împărțiți sistemul de reacție care conține molecule de acid nucleic în mii de picături la scară nanometrică, fiecare dintre acestea nu conține molecula țintă de acid nucleic care trebuie detectată sau Conține una până la mai multe molecule țintă de acid nucleic care trebuie testate.

3) PCR digitală bazată pe cip, cdPCR:

Utilizați tehnologia integrată a căii fluidelor pentru a grava multe microtuburi și microcavități pe plachete de siliciu sau sticlă de cuarț și controlați fluxul de soluție prin diferite supape de control și împărțiți proba de lichid în nanometri de aceeași dimensiune în godeurile de reacție pentru reacția PCR digitală pentru a obține cuantificarea absolută.

Principalele dezavantaje ale PCR de a treia generație:

Echipamentele și reactivii sunt scumpe.

Cerințele de calitate ale șablonului sunt ridicate.Dacă cantitatea șablonului depășește cantitatea microsistemului, va fi imposibil de cuantificat, iar dacă este prea mică, acuratețea cuantificării va fi redusă.

Fals pozitive pot fi generate și atunci când există o amplificare nespecifică.