COVID-19 este o boală infecțioasă cauzată de sindromul respirator acut sever Coronavirus tip 2. Când o persoană este infectată, cele mai frecvente simptome includ febră, tuse și dificultăți de respirație.

Probele utilizate pentru testare pot fi recoltate prin tampoane nazofaringiene sau orofaringiene.

Ce este PCR?

Metoda standard de detectare a coronavirusului este reacția în lanț a polimerazei, PCR.Aceasta este o metodă utilizată pe scară largă în biologia moleculară.Poate copia rapid milioane până la miliarde de fragmente specifice de ADN.

Noul coronavirus conține un genom ARN monocatenar foarte lung.Pentru a detecta acești virusuri prin PCR, moleculele de ARN trebuie convertite în secvențele lor complementare de ADN prin revers transcriptază, iar apoi ADN-ul nou sintetizat poate fi amplificat prin proceduri PCR standard, cunoscute în mod obișnuit ca RT-PCR.

Procesul RT-PCR

extracția ARN

Pentru a efectua această metodă, ARN-ul viral ar trebui, practic, să fie extras.O varietate de truse de purificare a ARN poate fi utilizată pentru o separare convenabilă, rapidă și eficientă.

Pentru a extrage ARN viral folosind un kit comercial, adăugați mai întâi proba într-un tub de microcentrifugă și apoi amestecați-o cu tamponul de liză.Acest tampon este foarte denaturat și constă de obicei din fenol și izotiocianat de guanidină.În plus, inhibitorii de RNază sunt de obicei prezenți în tamponul de liză pentru a asigura izolarea ARN viral intact.

După adăugarea tamponului de liză, agitați tubul de amestec prin puls și incubați la temperatura camerei.Virusul este apoi lizat în condiţii de înalt denaturare furnizate de tamponul de liză.

După ce proba este lizată, se folosește un tub de centrifugă pentru procedura de purificare.Eșantionul este încărcat în tubul de centrifugă și apoi centrifugat.

Această procedură este o metodă de extracție în fază solidă în care faza staționară constă dintr-o matrice de silicagel.

În condiții optime de sare și pH, moleculele de ARN se leagă de membrana de silice.

În același timp, proteinele și alți contaminanți sunt îndepărtați.

După centrifugare, puneți tubul de centrifugare într-un tub de colectare curat, aruncați filtratul și apoi adăugați tampon de spălare.

Puneți din nou tubul în centrifugă pentru a forța tamponul de spălare să treacă prin membrană.Acest lucru va elimina toate impuritățile rămase din membrană, lăsând doar ARN-ul legat de silicagel.

După spălarea probei, puneți tubul într-un tub de microcentrifugă curat și adăugați tamponul de eluție.

Apoi este centrifugat pentru a forța tamponul de eluție să treacă prin membrană.Tamponul de eluție elimină ARN viral din coloana de spin și obține ARN purificat fără proteine, inhibitori și alți contaminanți.

PASUL 2

Concentrat mixt

După extragerea ARN-ului viral, următorul pas este pregătirea amestecului de reacție pentru amplificarea PCR.În această etapă, se folosește concentratul.Această soluție concentrată este o soluție concentrată premixată constând dintr-un premix, transcriptază inversă, nucleotide, primer direct, primer invers, sondă TaqMan și ADN polimerază.

În cele din urmă, pentru a finaliza acest amestec de reacție, se adaugă șablonul ARN.Tuburile sunt amestecate prin vortexare cu impulsuri și apoi amestecul de reacție este încărcat în placa PCR.Placa PCR conține de obicei 96 de godeuri și poate analiza mai multe probe în același timp.

PASUL 3

Amplificare PCR

Apoi, plasați placa în mașina PCR, care este în esență un termociclator.

RT-PCR în timp real este utilizat pentru a detecta noul coronavirus din 2019 prin amplificarea secvenței țintă în gena RdrRP, gena E și gena N.Alegerea genei țintă depinde de secvența primerului și a sondei.

Primul pas al RT-PCR este transcrierea inversă.Este sintetizată prima catenă de ADN complementar, care este inițiată de primerul invers PCR, care se leagă de partea complementară a genomului ARN viral.Apoi, transcriptaza inversă adaugă nucleotide ADN la capătul 3' al primerului pentru a sintetiza ADN-ul complementar ARN-ului viral.Temperatura și durata acestei etape depind de primeri, ARN-ul țintă și transcriptaza inversă utilizate.

Apoi, se aplică o etapă inițială de denaturare, care are ca rezultat denaturarea hibridului ARN-ADN.Acest pas este necesar pentru a activa ADN polimeraza.În același timp, transcriptaza inversă este inactivată.

PCR constă dintr-o serie de cicluri termice.Fiecare ciclu constă în etape de denaturare, recoacere și extensie.

Etapa de denaturare implică încălzirea camerei de reacție la 95 de grade Celsius și utilizarea acesteia pentru denaturarea matriței ADN dublu catenar.

În următoarea etapă, temperatura de reacție este redusă la 58 de grade Celsius, permițând primerului direct să se recoace cu partea complementară a matriței ADN monocatenar.Temperatura de recoacere depinde direct de lungimea și compoziția grundului.

În etapa de extensie, ADN polimeraza sintetizează o nouă catenă de ADN care este complementară cu catena matriță de ADN.Prin adăugarea de nuclee libere complementare șablonului în direcția 5′ până la 3′ din amestecul de reacție.Temperatura acestei etape depinde de ADN polimeraza utilizată.

După primul ciclu, se obține o țintă de ADN dublu catenar.

Apoi, intră în al doilea ciclu.ADN-ul dublu catenar este denaturat pentru a produce două molecule de ADN monocatenar.

În etapa următoare, temperatura de reacție este coborâtă, primerii sunt recoapți la fiecare matriță de ADN monocatenar și sonda Taq-man este recoaptă la partea complementară a ADN-ului țintă.

Sonda TaqMan constă dintr-un fluorofor legat covalent la capătul 5' al sondei oligonucleotidice.Când este excitat de sursa de lumină a ciclorului, fluoroforul emite fluorescență.În plus, sonda este compusă dintr-un stingător la capătul 3′.Apropierea genei reporter de stingător împiedică detectarea fluorescenței.

În etapa de extensie, ADN polimeraza sintetizează o nouă catenă.Când polimeraza ajunge la sonda TaqMan, activitatea sa endogenă 5′nuclează scindează sonda, separând colorantul de stingător.

Cu fiecare ciclu de PCR, sunt eliberate mai multe molecule de colorant, rezultând o creștere a intensității fluorescenței proporțională cu numărul de ampliconi sintetizați.

Această metodă permite estimarea numărului unei secvențe date prezente în eșantion.Numărul de fragmente de ADN dublu catenar se dublează în fiecare ciclu.Prin urmare, PCR poate fi utilizată pentru a analiza probe foarte mici.

Pentru măsurarea semnalului fluorescent, lampă cu halogen de tungsten, filtru de excitație, reflector, lentilă, filtru de emisie și dispozitiv cuplat cu încărcare-folosește camera CCD.

PASUL 4 Detectează

Pentru măsurarea semnalului fluorescent, lampă cu halogen de tungsten, filtru de excitație, reflector, lentilă, filtru de emisie și dispozitiv cuplat cu încărcare-folosește camera CCD.

Lumina filtrată de la lampă este reflectată de reflector, trece prin lentila condensatorului și este focalizată spre centrul fiecărei găuri.Apoi, fluorescența emisă din gaură este reflectată de oglindă, trece prin filtrul de emisie și este detectată de camera CCD.În fiecare ciclu de PCR, lumina fluoroforului autoexcitată poate fi detectată de CCD.

Acesta convertește lumina captată în date digitale.Această metodă se numește PCR în timp real și permite monitorizarea în timp real a progresului reacției PCR.