RT-qPCR este dezvoltat din tehnologia PCR obișnuită.Acesta adaugă substanțe chimice fluorescente (coloranți fluorescenți sau sonde fluorescente) la sistemul tradițional de reacție PCR și detectează procesul de recoacere și extindere PCR în timp real, în funcție de diferitele mecanisme luminiscente ale acestora.Modificările semnalului fluorescent în mediu sunt utilizate pentru a calcula cantitatea de modificare a produsului în fiecare ciclu de PCR.În prezent, cele mai comune metode sunt metoda vopselei fluorescente și metoda sondei.

Metoda vopselei fluorescente:
Unii coloranți fluorescenți, cum ar fi SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO etc., nu emit lumină de la sine, dar emit fluorescență după ce se leagă de canalul minor al dsDNA.Prin urmare, la începutul reacției PCR, aparatul nu poate detecta semnalul fluorescent.Când reacția trece la etapa de recoacere-extensie (metoda în două etape) sau etapa de extensie (metoda în trei etape), catenele duble sunt deschise în acest moment, iar noua ADN polimerază În timpul sintezei catenelor, moleculele fluorescente sunt combinate în canalul minor dsDNA și emit fluorescență.Pe măsură ce numărul de cicluri PCR crește, tot mai mulți coloranți se combină cu dsDNA, iar semnalul fluorescent este, de asemenea, îmbunătățit continuu.Luați SYBR Green Ⅰ ca exemplu.
Metoda sondei:
Sonda Taqman este cea mai utilizată sondă de hidroliză.Există un grup fluorescent la capătul 5′ al sondei, de obicei FAM.Sonda în sine este o secvență complementară genei țintă.Există o grupare de stingere fluorescentă la capătul 3′ al fluoroforului.Conform principiului transferului de energie de rezonanță fluorescentă (Förster Resonance Energy Transfer, FRET), atunci când grupul fluorescent reporter (molecula fluorescentă donatoare) și grupul fluorescent de stingere (molecula fluorescentă acceptoare) Când spectrul de excitație se suprapune și distanța este foarte apropiată (7-10 nm), excitația moleculei donatorului poate induce autofluorescența donatorului, în timp ce molecula de fluorescență poate induce autofluorescența este slăbit.Prin urmare, la începutul reacției PCR, când sonda este liberă și intactă în sistem, grupul fluorescent reporter nu va emite fluorescență.La recoacere, primerul și sonda se leagă de șablon.În timpul etapei de extensie, polimeraza sintetizează continuu noi lanțuri.ADN polimeraza are activitate exonuclează 5′-3′.Când ajunge la sondă, ADN polimeraza va hidroliza sonda din șablon, va separa grupul fluorescent reporter de grupul fluorescent de extindere și va elibera semnalul fluorescent.Deoarece există o relație unu-la-unu între sondă și șablon, metoda sondei este superioară metodei cu colorare în ceea ce privește acuratețea și sensibilitatea testului.

Fig 1 Principiul qRT-PCR

Design grund
Principii:

Primerii ar trebui să fie proiectați în regiunea conservată a seriei de acid nucleic și să aibă specificitate.

Cel mai bine este să utilizați secvența de ADNc, iar secvența de ARNm este, de asemenea, acceptabilă.Dacă nu, aflați designul regiunii cds a secvenței ADN.
Lungimea produsului cantitativ fluorescent este de 80-150bp, cea mai lungă este de 300bp, lungimea primerului este în general între 17-25 de baze, iar diferența dintre primerii din amonte și din aval nu trebuie să fie prea mare.

Conținutul G+C este între 40% și 60%, iar 45-55% este cel mai bun.
Valoarea TM este între 58-62 de grade.
Încercați să evitați dimerii de primer și autodimerii, (nu apar mai mult de 4 perechi de baze complementare consecutive) structura ac de păr, dacă este inevitabil, faceți ΔG<4,5 kJ/mol* Dacă nu vă puteți asigura că gADN-ul a fost îndepărtat în timpul transcripției inverse Curățați, cel mai bine este să proiectați primerii intronului * Capătul 3′ nu poate fi evitat, structura AT2, T/C și bogată pentru a evita 3) grunduri și non-
specific Omologia secvenţei amplificate heterogen este de preferinţă mai mică de 70% sau are 8 omologie de baze complementare.
Bază de date:
Căutare CottonFGD după cuvinte cheie
Design grund:
Design primer IDT-qPCR

Fig2 Pagina cu instrumentul de proiectare a primerului online IDT

Afișarea paginii de rezultate Fig3
Proiectarea primerilor lncRNA:
lncRNA:aceleași pași ca ARNm.
miARN:Principiul metodei stem-loop: Deoarece toate miARN-urile sunt secvențe scurte de aproximativ 23 nt, detectarea directă PCR nu poate fi efectuată, așa că este utilizat instrumentul de secvență stem-loop.Secvența tulpină-buclă este un ADN monocatenar de aproximativ 50 nt, care poate forma o structură în ac de păr de la sine.3 „Capătul poate fi proiectat ca o secvență complementară fragmentului parțial de miARN, apoi miARN-ul țintă poate fi conectat la secvența stem-loop în timpul transcripției inverse, iar lungimea totală poate ajunge la 70bp, ceea ce este în concordanță cu lungimea produsului amplificat determinată de qPCR.Design primer miRNA de coadă.
Detectare specifică amplificarii:
Baza de date online de explozie: explozie CottonFGD după asemănarea secvenței
Explozie locală: Consultați utilizarea Blast+ pentru a face explozie locală, Linux și Macos pot stabili direct o bază de date locală, sistemul win10 poate fi realizat și după instalarea ubuntu bash.Creați o bază de date de explozie locală și explozie locală;deschide ubuntu bash pe win10.
Observație: bumbacul de suprafață și bumbacul de pe insulă marină sunt culturi tetraploide, astfel încât rezultatul exploziei va fi adesea două sau mai multe potriviri.În trecut, utilizarea CD-urilor NAU ca bază de date pentru a efectua explozie este probabil să găsească două gene omoloage cu doar câteva diferențe SNP.De obicei, cele două gene omoloage nu pot fi separate prin design primer, deci sunt tratate ca la fel.Dacă există un indel evident, primerul este de obicei proiectat pe indel, dar acest lucru poate duce la structura secundară a primerului Energia liberă devine mai mare, ducând la o scădere a eficienței de amplificare, dar acest lucru este inevitabil.

Detectarea structurii secundare a primerului:
Pași:deschideți oligo 7 → introduceți secvența șablonului → închideți sub-fereastra → salvați → localizați primerul pe șablon, apăsați ctrl+D pentru a seta lungimea primerului → analizați diferite structuri secundare, cum ar fi corp de autodimerizare, heterodimer, ac de păr, nepotrivire etc. Ultimele două imagini din Figura 4 sunt rezultatele testului primerilor.Rezultatul primerului frontal este bun, nu există o structură evidentă de dimer și ac de păr, nici baze complementare continue, iar valoarea absolută a energiei libere este mai mică de 4,5, în timp ce primerul din spate arată continuu Cele 6 baze sunt complementare, iar energia liberă este de 8,8;in plus, la capatul 3′ apare un dimer mai serios si apare un dimer de 4 baze consecutive.Deși energia liberă nu este mare, dimerul 3′ Chl poate afecta grav specificitatea și eficiența amplificării.În plus, este necesar să se verifice dacă există ac de păr, heterodimeri și nepotriviri.

Rezultatele detectării Fig3 oligo7
Detectarea eficienței de amplificare:
Eficiența de amplificare a reacției PCR afectează grav rezultatele PCR.De asemenea, în qRT-PCR, eficiența de amplificare este deosebit de importantă pentru rezultatele cantitative.Îndepărtați alte substanțe, mașini și protocoale din tamponul de reacție.Calitatea primerilor are, de asemenea, o mare influență asupra eficienței de amplificare a qRT-PCR.Pentru a asigura acuratețea rezultatelor, atât cuantificarea fluorescenței relative, cât și cuantificarea fluorescenței absolute trebuie să detecteze eficiența de amplificare a primerilor.Este recunoscut faptul că eficiența efectivă de amplificare qRT-PCR este între 85% și 115%.Există două metode:
1. Metoda curbei standard:
A.Se amestecă ADNc
b.Diluare gradient
c.qPCR
d.Ecuație de regresie liniară pentru calcularea eficienței de amplificare
2. LinRegPCR
LinRegPCR este un program pentru analiza datelor RT-PCR în timp real, numite și date PCR cantitative (qPCR) bazate pe SYBR Green sau chimie similară.Programul folosește date corectate non-linii de bază, efectuează o corecție de bază pe fiecare probă Separat, determină o fereastră de liniaritate și apoi utilizează analiza de regresie liniară pentru a se potrivi cu o linie dreaptă prin setul de date PCR.Din panta acestei linii se calculează eficiența PCR a fiecărei probe individuale.Eficiența medie PCR per amplicon și valoarea Ct per probă sunt utilizate pentru a calcula o concentrație inițială per probă, exprimată în unități de fluorescență arbitrare.Intrarea și ieșirea datelor se fac printr-o foaie de calcul Excel.Doar mostra
este necesară amestecarea, fără gradient
sunt necesari pasi:(Luați Bole CFX96 ca exemplu, nu chiar Mașină cu ABI clar)
experiment:este un experiment standard de qPCR.
Ieșire de date qPCR:LinRegPCR poate recunoaște două forme de fișiere de ieșire: RDML sau cuantificare Rezultat amplificare.De fapt, este valoarea de detecție în timp real a numărului ciclului și a semnalului de fluorescență de către mașină, iar amplificarea este obținută prin analizarea valorii modificării fluorescenței a eficienței segmentului liniar.
Selectarea datelor: În teorie, valoarea RDML ar trebui să fie utilizabilă.Se estimează că problema computerului meu este că software-ul nu poate recunoaște RDML, așa că am valoarea de ieșire Excel ca date originale.Este recomandat să efectuați mai întâi o screening brută a datelor, cum ar fi eșecul de a adăuga mostre etc. Punctele pot fi șterse din datele de ieșire (desigur, nu le puteți șterge, LinRegPCR va ignora aceste puncte în etapa ulterioară)

Fig5 Export de date qPCR

Fig6 selecția probelor candidate

Introducere a datelor:Deschideți calificarea amplificare results.xls, → deschideți LinRegPCR → fișier → citiți din excel → selectați parametrii așa cum se arată în Figura 7 → OK → faceți clic pe determinați liniile de bază

Fig7 pași de intrare a datelor linRegPCR

Rezultat:Dacă nu există repetare, nu este necesară gruparea.Dacă există repetare, gruparea poate fi editată în gruparea eșantionului, iar numele genei este introdus în identificator, iar apoi aceeași genă va fi grupată automat.În cele din urmă, faceți clic pe fișier, exportați Excel și vizualizați rezultatele.Vor fi afișate eficiența de amplificare și rezultatele R2 ale fiecărui godeu.În al doilea rând, dacă vă împărțiți în grupuri, va fi afișată eficiența medie de amplificare corectată.Asigurați-vă că eficiența de amplificare a fiecărui primer este între 85% și 115%.Dacă este prea mare sau prea mic, înseamnă că eficiența de amplificare a primerului este slabă.

Fig 8 Rezultat și date de ieșire

Proces experimental:
Cerințe de calitate ARN:
Puritate:1.72.0 indică faptul că poate exista izotiocianat rezidual.Acidul nucleic curat A260/A230 ar trebui să fie în jur de 2. Dacă există o absorbție puternică la 230 nm, înseamnă că există compuși organici, cum ar fi ionii fenat.În plus, poate fi detectat prin electroforeză pe gel de agaroză 1,5%.Indicați markerul, deoarece ARNss nu are denaturare și logaritmul greutății moleculare nu are o relație liniară, iar greutatea moleculară nu poate fi exprimată corect.Concentrare: teoreticnumai puțin de 100ng/ul, dacă concentrația este prea scăzută, puritatea este în general scăzută, nu înaltă

Fig9 gel ARN

În plus, dacă proba este prețioasă și concentrația de ARN este mare, se recomandă să o alicoți după extracție și să diluați ARN-ul la o concentrație finală de 100-300ng/ul pentru transcrierea inversă.Înprocesul de transcriere inversă, când ARNm este transcris, primerii oligo (dt) care se pot lega în mod specific la cozile poliA sunt utilizați pentru transcrierea inversă, în timp ce lncRNA și circRNA folosesc primeri hexameri aleatori (Random 6 mer) pentru transcrierea inversă a ARN-ului total.Multe companii au lansat acum truse speciale de decantare.Pentru metoda stem-loop, metoda tailing este mai convenabilă, cu randament ridicat și economisind reactiv, dar efectul distingerii miARN-urilor din aceeași familie nu ar trebui să fie la fel de bun ca metoda stem-loop.Fiecare trusă de transcripție inversă are cerințe pentru concentrarea primerilor specifici genei (bucle-tulpini).Referința internă folosită pentru miARN este U6.În procesul de inversare a tulpinii buclei, un tub de U6 ar trebui inversat separat, iar amorsele din față și din spate ale U6 ar trebui adăugate direct.Atât circRNA cât și lncRNA pot folosi HKG ca referință internă.Îndetectarea cADN-ului,
dacă nu există nicio problemă cu ARN-ul, și ADNc-ul ar trebui să fie bine.Cu toate acestea, dacă se urmărește perfecțiunea experimentului, cel mai bine este să folosiți o genă de referință internă (genă de referință, RG) care poate distinge ADNg de cd-uri.În general, RG este o genă menajeră., HKG) așa cum se arată în Figura 10;În acel moment, făceam proteine ​​de depozitare din soia și foloseam actină7 care conținea introni ca referință internă.Dimensiunea fragmentului amplificat al acestui primer în ADNg a fost de 452 pb, iar dacă ADNc a fost utilizat ca matriță, acesta a fost de 142 pb.Apoi, rezultatele testului au constatat că o parte din ADNc a fost de fapt contaminată de ADNg și, de asemenea, a dovedit că nu a existat nicio problemă cu rezultatul transcripției inverse și ar putea fi folosit ca șablon pentru PCR.Este inutil să efectuați electroforeza pe gel de agaroză direct cu ADNc și este o bandă difuză, ceea ce nu este convingător.

Fig. 10 Detectarea cADN

Determinarea condițiilor qPCRîn general, nu este nicio problemă conform protocolului kit-ului, în principal în pasul valorii tm.Dacă unii primeri nu sunt bine proiectați în timpul proiectării primerului, rezultând o diferență mare între valoarea tm și 60°C teoretic, se recomandă ca ADNc-ul După ce probele sunt amestecate, să rulați o PCR cu gradient cu primeri și să încercați să evitați setarea temperaturii fără benzi ca valoare TM.

Analiza datelor

Metoda convențională de procesare cantitativă PCR cu fluorescență relativă este în principiu conform 2-ΔΔCT.Șablon de prelucrare a datelor.

Produse asemanatoare:

PCR în timp real ușor^TM – Taqman

PCR în timp real ușor^TM -SYBR VERDE I

RT Easy I (Master Premix pentru sinteza cADN-ului primei catene)

RT Easy II (Master Premix pentru sinteza cADN-ului primei catene pentru qPCR)