一、Crește sensibilitatea sistemului de reacție:

1. Izolați ARN de înaltă calitate:

Sinteza de succes a ADNc provine din ARN de înaltă calitate.ARN-ul de înaltă calitate ar trebui să fie cel puțin de lungime completă și să nu aibă inhibitori de revers transcriptază, cum ar fi EDTA sau SDS.Calitatea ARN-ului determină cantitatea maximă de informații de secvență pe care o puteți transcrie în ADNc.O metodă obișnuită de purificare a ARN este o metodă într-o singură etapă care utilizează izotiocianat de guanidină/fenol acid.Pentru a preveni contaminarea cu urme de RNază, ARN-ul izolat din probe bogate în RNază (cum ar fi pancreasul) trebuie depozitat în formaldehidă pentru a păstra ARN de înaltă calitate, în special pentru depozitarea pe termen lung.ARN-ul extras din ficatul de șobolan a fost practic degradat după ce a fost păstrat în apă timp de o săptămână, în timp ce ARN-ul extras din splina de șobolan a rămas stabil după ce a fost păstrat în apă timp de 3 ani.În plus, transcrierile mai lungi de 4 kb sunt mai sensibile la degradarea prin urme de RNaze decât transcriptele mici.Pentru a crește stabilitatea probelor de ARN stocate, ARN-ul poate fi dizolvat în formamidă deionizată și depozitat la -70°C.Formamida utilizată pentru conservarea ARN-ului trebuie să fie lipsită de resturi care degradează ARN-ul.ARN-ul din pancreas poate fi păstrat în formamidă timp de cel puțin un an.Când vă pregătiți pentru a utiliza ARN, puteți utiliza următoarea metodă pentru a precipita ARN: adăugați NaCl la 0,2 M și de 4 ori volumul de etanol, puneți la temperatura camerei timp de 3-5 minute și centrifugați la 10.000×g timp de 5 minute.

2. Utilizați transcriptaza inversă RNaseH-inactivă (RNaseH-):

Inhibitorii de RNază sunt adesea adăugați la reacțiile de transcripție inversă pentru a crește lungimea și randamentul sintezei cADN.Inhibitorii de RNază trebuie adăugați în timpul reacției de sinteză a primei catene în prezența unui tampon și a unui agent reducător (cum ar fi DTT), deoarece procesul anterior sintezei cADN-ului denaturează inhibitorul, eliberând astfel RNază legată care poate degrada ARN-ul.Inhibitorii de proteină RNază previn doar degradarea ARN de către RNază A, B, C și nu împiedică RNază pe piele, așa că aveți grijă să nu introduceți RNază de la degete, în ciuda utilizării acestor inhibitori.

Reverse transcriptaza catalizează conversia ARN în cADN.Atât M-MLV, cât și AMV au activitate endogenă RNaseH în plus față de propria lor activitate de polimerază.Activitatea RNaseH și activitatea polimerazei concurează între ele pentru catena hibridă formată între matrița de ARN și primerul ADN sau catena de extensie a ADNc și degradează catena de ARN din complexul ARN:ADN.Șablonul de ARN degradat de activitatea RNaseH nu mai poate servi ca substrat eficient pentru sinteza ADNc, ceea ce reduce randamentul și lungimea sintezei ADNc.Prin urmare, ar fi benefic să se elimine sau să se reducă foarte mult activitatea RNaseH a transcriptazei inverse.。

Transcriptaza inversă SuperScript Ⅱ, transcriptaza inversă RNaseH-MMLV și transcriptaza inversă thermoScript, RNaseH-AMV, pot obține mai multă cantitate și mai mult ADNc de lungime completă decât MMLV și AMV.Sensibilitatea RT-PCR va fi afectată de cantitatea de sinteză de cADN.ThermoScript este mult mai sensibil decât AMV.Dimensiunea produselor RT-PCR este limitată de capacitatea transcriptazei inverse de a sintetiza ADNc, în special atunci când se clonează ADNc mai mari.În comparație cu MMLV, SuperScripⅡ a crescut semnificativ randamentul produselor RT-PCR lungi.RNaseH-reverse transcriptaza are, de asemenea, termostabilitate crescută, astfel încât reacția poate fi efectuată la temperaturi mai mari decât normale 37-42°C.În condițiile de sinteză sugerate, utilizați primer oligo(dT) și 10 μCi de [α-P]dCTP.Randamentul total al primului fir a fost calculat folosind metoda de precipitare TCA.ADNc de lungime completă a fost analizat utilizând benzi sortate în funcție de mărime, excizate și numărate pe un gel de agaroză alcalină.

3. Ridicați temperatura de incubare pentru transcrierea inversă:

O temperatură mai mare de incubare ajută la deschiderea structurii secundare a ARN, crescând randamentul reacției.Pentru majoritatea modelelor de ARN, incubarea ARN-ului și primerilor la 65°C fără tampon sau sare, urmată de răcire rapidă pe gheață va elimina majoritatea structurilor secundare și va permite primerilor să se lege.Cu toate acestea, unele șabloane au încă structuri secundare, chiar și după denaturarea termică.Amplificarea acestor șabloane dificile poate fi efectuată utilizând ThermoScript Reverse Transcriptase și plasând reacția de reverstranscripție la o temperatură mai ridicată pentru a îmbunătăți amplificarea.Temperaturile mai ridicate de incubare pot crește, de asemenea, specificitatea, mai ales atunci când primerii specifici genei (GSP) sunt utilizați pentru sinteza cADN (vezi capitolul 3).Dacă utilizați GSP, asigurați-vă că Tm al primerilor este același cu temperatura de incubare așteptată.Nu utilizați oligo(dT) și primeri aleatoriu peste 60°C.Primerii aleatoriu necesită incubare la 25°C timp de 10 minute înainte de a crește la 60°C.Pe lângă utilizarea unei temperaturi mai ridicate de transcripție inversă, specificitatea poate fi îmbunătățită și prin transferul direct a amestecului de ARN/primer de la temperatura de denaturare de 65°C la temperatura de incubare a transcripției inverse și adăugând un amestec de reacție 2x preîncălzit (sinteză cu pornire la cald ADNc).Această abordare ajută la prevenirea împerecherii de baze intermoleculare care are loc la temperaturi mai scăzute.Comutarea multiplă a temperaturii necesară pentru RT-PCR poate fi simplificată prin utilizarea unui termociclor.

A-a polimeraza termostabilă acționează ca o ADN polimerază în prezența Mg2+ și ca o ARN polimerază în prezența Mn2+.Se poate menține cald la o temperatură maximă de 65°C.Cu toate acestea, prezența Mn2+ în timpul PCR reduce fidelitatea, ceea ce face ca polimeraza Tth să fie mai puțin potrivită pentru amplificarea de înaltă precizie, cum ar fi donarea ADNc.În plus, Tth are o eficiență scăzută a transcripției inverse, ceea ce reduce sensibilitatea și, deoarece transcripția inversă și PCR pot fi efectuate cu o singură enzimă, reacțiile de control fără transcripție inversă nu pot fi utilizate pentru a compara produsele de amplificare a ADNc cu ADN-ul genomic contaminant.Produsele de amplificare au fost separate.

4. Aditivi care promovează transcrierea inversă:

Aditivii, inclusiv glicerol și DMSO, sunt adăugați la reacția de sinteză a primei catene, care poate reduce stabilitatea dublei catene a acidului nucleic și poate dezlega structura secundară a ARN-ului.Se pot adăuga până la 20% glicerol sau 10% DMSO fără a afecta activitatea SuperScript II sau MMLV.AMV poate tolera, de asemenea, până la 20% glicerol fără pierderea activității.Pentru a maximiza sensibilitatea RT-PCR în reacția de transcripție inversă SuperScriptⅡ, se poate adăuga 10% glicerol și se poate incuba la 45°C.Dacă la PCR se adaugă 1/10 din produsul reacției de transcripție inversă, atunci concentrația de glicerol în reacția de amplificare este de 0,4%, ceea ce nu este suficient pentru a inhiba PCR.

5. Tratament cu RNaseH:

Tratamentul reacțiilor de sinteză a ADNc cu RNaseH înainte de PCR poate crește sensibilitatea.Pentru unele șabloane, se crede că ARN-ul din reacția de sinteză a ADNc previne legarea produselor de amplificare, caz în care tratamentul cu RNaseH poate crește sensibilitatea.În general, tratamentul cu RNaseH este necesar atunci când se amplifică șabloane țintă de ADNc de lungime întreagă mai lungi, cum ar fi scheroza II tuberoasă cu copii reduse.Pentru acest șablon dificil, tratamentul cu RNaseH a îmbunătățit semnalul produs de ADNc SuperScript II sau AMV-sintetizat.Pentru majoritatea reacțiilor RT-PCR, tratamentul cu RNaseH este opțional, deoarece etapa de denaturare a PCR la 95°C hidrolizează în general ARN-ul din complexul ARN:ADN.

6. Îmbunătățirea metodei de detectare a ARN-ului mic:

RT-PCR este deosebit de dificilă atunci când sunt disponibile doar cantități mici de ARN.Glicogenul adăugat ca purtător în timpul izolării ARN ajută la creșterea randamentului probelor mici.Glicogenul fără RNază poate fi adăugat în același timp cu adăugarea Trizolului.Glicogenul este solubil în apă și poate fi menținut în fază apoasă cu ARN pentru a ajuta precipitarea ulterioară.Pentru probele mai mici de 50 mg de țesut sau 106 celule cultivate, concentrația recomandată de glicogen fără RNază este de 250 μg/ml.

Adăugarea de BSA acetilat la reacția de transcripție inversă folosind SuperScript II poate crește sensibilitatea, iar pentru cantități mici de ARN, reducerea cantității de SuperScript II și adăugarea a 40 de unități de inhibitor de nuclează RNaseOut poate crește nivelul de detectare.Dacă glicogenul este utilizat în procesul de izolare a ARN, este totuși recomandat să adăugați inhibitor de BSA sau RNază atunci când utilizați SuperScript II pentru reacția de transcripție inversă.

二、Crește specificitatea RT-PCR

1. Asinteză CND:

Sinteza ADNc-ului prima catenă poate fi inițiată folosind trei metode diferite, a căror specificitate relativă afectează cantitatea și tipul de ADNc sintetizat.

Metoda primerului aleatoriu a fost cea mai puțin specifică dintre cele trei metode.Primerii se recoapează în mai multe locuri pe tot parcursul transcrierii, generând cADN-uri scurte, de lungime parțială.Această metodă este frecvent utilizată pentru a obține secvențe de capăt 5′ și pentru a obține ADNc din matrițe de ARN cu regiuni de structură secundară sau cu situsuri de terminare care nu pot fi replicate prin revers transcriptază.Pentru a obține cel mai lung ADNc, raportul dintre primeri și ARN din fiecare probă de ARN trebuie determinat empiric.Concentrația inițială a primerilor aleatori a variat de la 50 la 250 ng la 20 μl de reacție.Deoarece cADN sintetizat din ARN total folosind primeri aleatori este în primul rând ARN ribozomal, poli(A)+ARN este în general ales ca șablon.

Primerii oligo(dT) sunt mai specifici decât primerii aleatori.Se hibridizează cu coada poli(A) găsită la capătul 3′ al majorității ARNm eucariote.Deoarece ARN poli(A)+ reprezintă aproximativ 1% până la 2% din ARN total, cantitatea și complexitatea ADNc este mult mai mică decât la primeri aleatori.Datorită specificității sale ridicate, oligo(dT) în general nu necesită optimizarea raportului dintre ARN și primeri și selecția poli(A)+.Se recomandă utilizarea a 0,5μg oligo(dT) per 20μl de sistem de reacție.oligo(dT)12-18 este potrivit pentru majoritatea RT-PCR.Sistemul ThermoScript RT-PCR oferă oligo(dT)20 datorită stabilității sale termice mai bune pentru temperaturi de incubare mai ridicate.

Primerii specifici genei (GSP) sunt cei mai specifici primeri pentru etapa de transcriere inversă.GSP este o oligonucleotidă antisens care se poate hibridiza în mod specific cu secvența țintă de ARN, spre deosebire de primerii aleatorii sau oligo(dT), care se aliniază la toate ARN-urile.Aceleași reguli utilizate pentru proiectarea primerilor PCR se aplică și proiectării GSP în reacțiile de transcripție inversă.GSP poate fi aceeași secvență ca primerul de amplificare care se aliniază la capătul cel mai 3′ al ARNm, sau GSP poate fi proiectat să se recoace în aval de primerul de amplificare inversă.Pentru unii subiecți amplificați, mai mult de un primer antisens trebuie proiectat pentru RT-PCR de succes, deoarece structura secundară a ARN-ului țintă poate preveni legarea primerului.Se recomandă utilizarea a 1 pmol GSP antisens într-o reacție de sinteză a primului caten de 20 μl.

2. Ridicați temperatura de incubație pentru transcrierea inversă:

Pentru a profita pe deplin de avantajul maxim al specificității GSP, ar trebui utilizată o revers transcriptază cu termostabilitate mai mare.Reverse transcriptazele termostabile pot fi incubate la temperaturi mai ridicate pentru a crește stringența reacției.De exemplu, dacă un GSP se recoace la 55°C, specificitatea GSP nu va fi utilizată pe deplin dacă AMV sau M-MLV este utilizat pentru transcrierea inversă la o stringență scăzută de 37°C.Cu toate acestea, SuperScript II și ThermoScript pot reacționa la 50°C sau mai mult, ceea ce va elimina produsele nespecifice generate la temperaturi mai scăzute.Pentru o specificitate maximă, amestecul de ARN/primer poate fi transferat direct de la temperatura de denaturare de 65°C la temperatura de incubare a transcripției inverse și adăugat la un amestec de reacție 2x preîncălzit (pornire la cald pentru sinteza ADNc).Acest lucru ajută la prevenirea împerecherii bazelor intermoleculare la temperaturi scăzute.Tranzițiile multiple de temperatură necesare pentru RT-PCR pot fi simplificate prin utilizarea unui termociclor.

3. Reduce contaminarea ADN-ului genomic:

O posibilă dificultate întâlnită cu RT-PCR este contaminarea ADN-ului genomic în ARN.Utilizarea unei metode bune de izolare a ARN, cum ar fi reactivul Trizol, va reduce cantitatea de ADN genomic care contaminează preparatul de ARN.Pentru a evita produsele derivate din ADN-ul genomic, ARN-ul poate fi tratat cu DNază I de grad de amplificare pentru a elimina ADN-ul contaminant înainte de transcrierea inversă.Digestia cu ADNază I a fost încheiată prin incubarea probelor în 2,0 mM EDTA timp de 10 minute la 65°C.EDTA poate chela ionii de magneziu, prevenind hidroliza ARN dependentă de ioni de magneziu la temperaturi ridicate.

Pentru a separa cADN-ul amplificat de produsele contaminante de amplificare a ADN-ului genomic, primeri pot fi proiectați care să se recoace fiecare pentru a separa exonii.Produsele PCR derivate din ADNc vor fi mai scurte decât cele derivate din ADN-ul genomic contaminat.În plus, a fost efectuat un experiment de control fără transcripție inversă pe fiecare matriță de ARN pentru a determina dacă un fragment dat a fost derivat din ADN genomic sau ADNc.Produsul PCR obținut fără transcripție inversă este derivat din genom.