1. Cunoștințe de bază (dacă doriți să vedeți partea experimentală, vă rugăm să transferați direct la a doua parte)
Ca o reacție derivată a PCR convențională, PCR în timp real monitorizează în principal modificarea cantității de produs de amplificare în fiecare ciclu al reacției de amplificare PCR în timp real prin modificarea semnalului de fluorescență și analizează cantitativ șablonul de pornire prin relația dintre valoarea ct și curba standard.
Datele specifice ale RT-PCR suntde bază, pragul de fluorescențășiValoarea Ct.
| de bază: | Valoarea fluorescenței din ciclul 3-15 este linia de bază (linia de bază), care este cauzată de o eroare ocazională a măsurării. |
| Prag (prag): | Se referă la limita de detectare a fluorescenței stabilită la o poziție adecvată în regiunea de creștere exponențială a curbei de amplificare, în general de 10 ori deviația standard a liniei de bază. |
| Valoarea CT: | Este numărul de cicluri PCR când valoarea fluorescenței din fiecare tub de reacție atinge pragul. Valoarea Ct este invers proporțională cu cantitatea de șablon inițial. |
Metode comune de etichetare pentru RT-PCR:
| metodă | avantaj | neajuns | scopul aplicatiei |
| SYBR GreenⅠ | Aplicabilitate largă, sensibil, ieftin și convenabil | Cerințele de amorsare sunt mari, predispuse la benzi nespecifice | Este potrivit pentru analiza cantitativă a diferitelor gene țintă, cercetarea expresiei genelor și cercetarea animalelor și plantelor recombinate transgenice. |
| TaqMan | Specificitate bună și repetabilitate ridicată | Prețul este mare și potrivit doar pentru obiective specifice. | Detectarea agenților patogeni, cercetarea genelor de rezistență la medicamente, evaluarea eficacității medicamentelor, diagnosticarea bolilor genetice. |
| far molecular | Specificitate ridicată, fluorescență, fundal scăzut | Prețul este mare, este potrivit doar pentru un anumit scop, designul este dificil și prețul este mare. | Analiza specifică a genelor, analiza SNP |
2. Etape experimentale
2.1 Despre gruparea experimentală- trebuie să existe mai multe puțuri în grup și să existe repetiții biologice.
| ① | Control gol | Folosit pentru a detecta starea de creștere a celulelor în experimente |
| ② | Control negativ siARN (secvență nespecifică de siARN) | Demonstrați specificitatea acțiunii ARNi.ARNsi poate induce răspuns la stres nespecific la o concentrație de 200 nM. |
| ③ | Controlul reactivului de transfecție | Excludeți toxicitatea reactivului de transfecție la celule sau efectul asupra expresiei genei țintă |
| ④ | siARN împotriva genei țintă | Doborâți expresia genei țintă |
| ⑤ (opțional) | siARN pozitiv | Folosit pentru a depana sistemele experimentale și problemele operaționale |
| ⑥ (opțional) | siRNA de control fluorescent | Eficiența transfecției celulare poate fi observată cu un microscop |
2.2 Principii de proiectare a grundului
| Dimensiunea fragmentului amplificat | De preferință la 100-150bp |
| Lungimea grundului | 18-25 pb |
| Conținutul GC | 30%-70%, preferabil 45%-55% |
| Valoarea Tm | 58-60℃ |
| Secvenţă | Evitați T/C continuu;A/G continuu |
| 3 secvență finală | Evitați GC bogat sau AT bogat;baza terminală este de preferinţă G sau C;cel mai bine este să evitați T |
| Complementaritatea | Evitați secvențele complementare de mai mult de 3 baze în interiorul primerului sau între doi primeri |
| Specificitate | Utilizați căutarea de explozie pentru a confirma specificitatea primerului |
①SiRNA este specific speciei, iar secvențele diferitelor specii vor fi diferite.
②SiRNA este ambalat în pulbere liofilizată, care poate fi păstrată stabil timp de 2-4 săptămâni la temperatura camerei.
2.3 Instrumente sau reactivi care trebuie pregătiți în prealabil
| Primer (referință internă) | Inclusiv înainte și înapoi doi |
| Primeri (genă țintă) | Inclusiv înainte și înapoi doi |
| ARN Si țintă (3 benzi) | În general, compania va sintetiza 3 benzi, apoi alege una dintre cele trei prin RT-PCR |
| Kit de transfecție | Lipo2000 etc. |
| Kit de extracție rapidă ARN | Pentru extracția ARN după transfecție |
| Kit de transcriere inversă rapidă | pentru sinteza cADN |
| Kit de amplificare PCR | 2×Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 În ceea ce privește aspectele cărora trebuie să se acorde atenție în etapele experimentale specifice:
①procesul de transfecție ARNsi
1. Pentru placare, puteți alege o placă cu 24 de godeuri, o placă cu 12 godeuri sau o placă cu 6 godeuri (concentrația medie de ARN propusă în fiecare godeu a unei plăci cu 24 de godeuri este de aproximativ 100-300 ng/uL), iar densitatea optimă de transfecție a celulelor este de până la 60 % -80% sau cam asa ceva
2. Etapele de transfecție și cerințele specifice sunt strict în conformitate cu instrucțiunile.
3. După transfecție, probele pot fi colectate în 24-72 de ore pentru detectarea ARNm (RT-PCR) sau detectarea proteinelor în 48-96 ore (WB)
② procesul de extracție a ARN
1. Preveniți contaminarea cu enzime exogene.Include în principal purtarea măștilor și mănușilor strict;folosind vârfuri de pipetă și tuburi EP sterilizate;apa folosită în experiment trebuie să fie fără RNază.
2. Se recomandă să faceți de două ori așa cum este sugerat în trusa de extracție rapidă, ceea ce va îmbunătăți cu adevărat puritatea și randamentul.
3. Lichidul rezidual nu trebuie să atingă coloana de ARN.
③ cuantificarea ARN
După ce ARN-ul este extras, acesta poate fi cuantificat direct cu Nanodrop, iar citirea minimă poate fi de până la 10ng/ul.
④Procesul de transcriere inversă
1. Datorită sensibilității ridicate a RT-qPCR, trebuie făcute cel puțin 3 godeuri paralele pentru fiecare probă pentru a preveni ca Ct ulterioară să fie prea diferită sau SD să fie prea mare pentru analiza statistică.
2. Nu înghețați și dezghețați Master Mix în mod repetat.
3. Fiecare tub/orificiu trebuie înlocuit cu un vârf nou!Nu folosiți în mod continuu același vârf de pipetă pentru a adăuga mostre!
4. Filmul atașat la placa cu 96 de godeuri după adăugarea probei trebuie netezit cu o placă.Cel mai bine este să centrifugi înainte de a-l pune pe mașină, astfel încât lichidul de pe peretele tubului să poată curge în jos și să elimine bulele de aer.
⑤ Analiza curbei comune
| Nicio perioadă de creștere logaritmică | Posibil concentrație mare de șablon |
| Fără valoare CT | Pași incorecți pentru detectarea semnalelor fluorescente; degradarea primerilor sau a sondelor – integritatea acestuia poate fi detectată prin electroforeză PAGE; cantitate insuficientă de șablon; degradarea șabloanelor – evitarea introducerii de impurități și a înghețarii și decongelarii repetate în prepararea probelor; |
| Ct>38 | Eficiență scăzută de amplificare;Produsul PCR este prea lung;diferite componente ale reacției sunt degradate |
| Curba de amplificare liniară | Sondele pot fi parțial degradate de cicluri repetate de îngheț-dezgheț sau de expunere prelungită la lumină |
| Diferența dintre găurile duplicate este deosebit de mare | Soluția de reacție nu este complet topită sau soluția de reacție nu este amestecată;baia termală a instrumentului PCR este contaminată cu substanţe fluorescente |
2.5 Despre analiza datelor
Analiza datelor qPCR poate fi împărțită în cuantificare relativă și cuantificare absolută.De exemplu, celulele din grupul de tratament în comparație cu celulele din grupul de control,
De câte ori se modifică ARNm al genei X, aceasta este o cuantificare relativă;într-un anumit număr de celule, ARNm al genei X
Câte exemplare sunt, aceasta este cuantificare absolută.De obicei, ceea ce folosim cel mai mult în laborator este metoda cantitativă relativă.De obicei,metoda 2-ΔΔcteste folosit cel mai mult în experimente, deci doar această metodă va fi introdusă în detaliu aici.
Metoda 2-ΔΔct: Rezultatul obținut este diferența de expresie a genei țintă în grupul experimental față de gena țintă din grupul de control.Este necesar ca eficiența de amplificare atât a genei țintă, cât și a genei de referință internă să fie aproape de 100%, iar abaterea relativă să nu depășească 5%.
Metoda de calcul este următoarea:
Δct grup de control = valoarea ct a genei țintă în grupul de control – valoarea ct a genei de referință internă în grupul de control
Δct grup experimental = valoarea ct a genei țintă în grupul experimental – valoarea ct a genei de referință internă în grupul experimental
ΔΔct=Δct grup experimental-Δct grup de control
În cele din urmă, calculați multiplu al diferenței în nivelul de expresie:
Change Fold=2-ΔΔct (corespunzător funcției Excel este POWER)
Produse asemanatoare:
Ora postării: 20-mai-2023
