Material de pornire: ARN
PCR cu transcripție inversă cantitativă (RT-qPCR) este o metodă experimentală utilizată în experimentele PCR folosind ARN ca material de pornire.În această metodă, ARN-ul total sau ARN-ul mesager (ARNm) este mai întâi transcris în ADN complementar (ADNc) prin transcriptază inversă.Ulterior, a fost efectuată o reacție qPCR folosind cADN-ul ca șablon.RT-qPCR a fost utilizat într-o varietate de aplicații de biologie moleculară, inclusiv analiza expresiei genelor, validarea interferenței ARN, validarea microarray, detectarea agenților patogeni, testarea genetică și cercetarea bolilor.
Metode într-un singur pas și în două etape pentru RT-qPCR
RT-qPCR poate fi realizat printr-o metodă într-o etapă sau în două etape.RT-qPCR într-o etapă combină transcripția inversă și amplificarea PCR, permițând transcriptazei inverse și ADN polimerazei să finalizeze reacția în același tub în aceleași condiții tampon.RT-qPCR într-o etapă necesită doar utilizarea primerilor specifici secvenței.În RT-qPCR în două etape, transcripția inversă și amplificarea PCR sunt efectuate în două tuburi, folosind diferite tampoane optimizate, condiții de reacție și strategii de proiectare a primerului.
| Avantaj | Dezavantaj | |
| Un pas | Această metodă are mai puține erori experimentale, deoarece ambele reacții sunt efectuate într-un singur tub
Mai puține etape de pipetare reduc riscul de contaminare
Potrivit pentru amplificare/screening cu randament ridicat, rapid și reproductibil | Reacțiile în doi pași nu pot fi optimizate separat
Deoarece condițiile de reacție sunt compromise prin combinarea reacției în două etape, sensibilitatea nu este la fel de bună ca cea a metodei în două etape
Numărul de ținte detectate de un singur eșantion este mic |
| Doi Pași | Abilitatea de a crea biblioteci stabile de ADNc care pot fi stocate pentru perioade lungi de timp și utilizate în reacții multiple
Genele țintă și genele de referință pot fi amplificate din aceeași bibliotecă de ADNc fără a fi nevoie de mai multe biblioteci de ADNc
Tampoane de reacție și condiții de reacție care permit optimizarea rulărilor de reacție unică
Selectarea flexibilă a condițiilor de declanșare | Utilizarea mai multor tuburi și a mai multor etape de pipetare crește riscul de contaminare a ADN-ului, și consumatoare de timp.
Necesită mai multă optimizare decât metoda într-un singur pas |
Produse asemanatoare:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix pentru sinteza CDNA a primului cadru
Kit PCR în timp real Easyᵀᴹ-SYBR Green I
Selectarea ARN total și ARNm
Când se proiectează un experiment RT-qPCR, este important să se decidă dacă se utilizează ARN total sau ARNm purificat ca șablon pentru transcrierea inversă.Deși ARNm poate fi capabil să ofere o sensibilitate puțin mai mare, ARN-ul total este încă utilizat frecvent.Motivul pentru aceasta este că ARN-ul total are un avantaj mai important ca materie primă decât ARNm.În primul rând, procesul necesită mai puține etape de purificare, ceea ce asigură o mai bună recuperare cantitativă a șablonului și o mai bună normalizare a rezultatelor la numărul de celule inițiale.În al doilea rând, evită etapa de îmbogățire a ARNm, care poate evita posibilitatea unor rezultate distorsionate din cauza recuperărilor diferite ale diferitelor ARNm.În general, deoarece în majoritatea aplicațiilor cuantificarea relativă a genei țintă este mai importantă decât sensibilitatea absolută a detectării, ARN-ul total este mai potrivit în majoritatea cazurilor.
Primer de transcriere inversă
În metoda în două etape, pot fi utilizate trei metode diferite pentru a amorsa reacția ADNc: primeri oligo(dT), primeri aleatori sau primeri specifici secvenței.De obicei, primerii oligo(dT) și primerii aleatori sunt utilizați în combinație.Acești primeri se aliniază la catena de ARNm șablon și oferă transcriptază inversă cu un punct de plecare pentru sinteză.
| Selectarea amorsei | Structură și funcție | Avantaj | Dezavantaj |
| Primer oligo(dT) (sau primer oligo(dT) ancorat) | Recoacere extinsă la reziduurile de timină la coada poli(A) a ARNm;Primerul oligo(dT) de ancorare conține un G, C sau A la capătul 3′ (locul de ancorare) | Sinteza ADNc de lungime completă din ARNm cu coadă poli(A).
Se aplică atunci când este disponibilă mai puțină materie primă
Locul de ancorare asigură că primerul oligo(dT) se leagă de coada 5′ poli(A) a ARNm | Potrivit doar pentru amplificarea genelor cu cozi poli(A).
Obține ADNc trunchiat de la locul de amorsare*2 în poli(A)
Parțial pentru a se lega la capătul 3′*
*Această posibilitate este redusă la minimum dacă se folosesc primeri oligo(dT) ancorați |
| primer aleatoriu
| 6 până la 9 baze în lungime, care se pot coace la mai multe locuri în timpul transcripției ARN | Se aliniază la toate ARN-urile (ARNt, ARNr și ARNm)
Potrivit pentru transcrierile cu structură secundară semnificativă sau când este disponibilă mai puțină materie primă
Randament ridicat de ADNc | ADNc este transcris invers din tot ARN-ul, ceea ce de obicei nu este dorit și poate dilua semnalul ARNm-țintă
obține ADNc trunchiat |
| primeri specifici secvenţei | Primeri personalizați care vizează secvențe specifice de ARNm | bibliotecă de ADNc specifică
Îmbunătățiți sensibilitatea
Folosind primeri qPCR invers | Limitat doar la sinteza unei singure gene țintă |
Reverse transcriptaza
Reverse transcriptaza este o enzimă care utilizează ARN pentru a sintetiza ADN.Unele transcriptaze inverse au activitate RNază și pot degrada catenele de ARN în catenele hibride ARN-ADN după transcripție.Dacă nu are activitate enzimatică RNază, RNaseH poate fi adăugată pentru o eficiență mai mare a qPCR.Enzimele utilizate în mod obișnuit includ transcriptaza inversă a virusului leucemiei murine Moloney și transcriptaza inversă a virusului mieloblastomului aviar.Pentru RT-qPCR, este ideal să se aleagă o transcriptază inversă cu termostabilitate mai mare, astfel încât sinteza cADN-ului să poată fi efectuată la temperaturi mai ridicate, asigurând transcrierea reușită a ARN-urilor cu structură secundară superioară, menținând în același timp activitatea deplină a acestora pe toată durata reacției, rezultând randamente mai mari de cDNA.
Produse asemanatoare:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptaza
Activitatea RNazei H a transcriptazei inverse
RNaseH este capabil să degradeze catenele de ARN din duplexurile ARN-ADN, permițând sinteza eficientă a ADN-ului dublu catenar.Cu toate acestea, când se utilizează ARNm lung ca șablon, ARN-ul poate fi degradat prematur, rezultând ADNc trunchiat.Prin urmare, este adesea benefic să se minimizeze activitatea RNaseH în timpul clonării ADNc dacă se dorește sinteza transcriptelor lungi.În contrast, transcriptazele inverse cu activitate RNază H sunt adesea benefice pentru aplicațiile qPCR, deoarece îmbunătățesc topirea duplexurilor ARN-ADN în timpul primului ciclu de PCR.
Design grund
Primerii PCR utilizați pentru etapa qPCR în RT-qPCR ar trebui să fie proiectați în mod ideal pentru a acoperi o joncțiune exon-exon, unde un primer de amplificare ar putea acoperi o limită reală exon-intron.Deoarece secvențele de ADN genomic care conțin introni nu sunt amplificate, acest design reduce riscul de amplificare a rezultatelor fals pozitive din contaminarea ADN-ului genomic.
Dacă primerii nu pot fi proiectați pentru a separa exonii sau limitele exon-exon, poate fi necesar să se trateze probele de ARN cu DNază I sau dsDNază fără RNază pentru a elimina contaminarea ADN-ului genomic.
Control RT-qPCR
Un control negativ al transcripției inverse (control -RT) ar trebui inclus în toate experimentele RT-qPCR pentru a detecta contaminarea ADN-ului (cum ar fi ADN-ul genomic sau produsele PCR din reacțiile anterioare).Acest control conține toate componentele reacției, cu excepția transcriptazei inverse.Deoarece transcripția inversă nu are loc cu acest control, dacă se observă amplificarea PCR, contaminarea cu ADN este cea mai probabilă.
Ora postării: Aug-02-2022
