• PCR este o metodă folosită pentru a amplifica ADN-ul dintr-o cantitate mică de matriță ADN.RT-PCR utilizează transcripția inversă pentru a produce un șablon ADN dintr-o sursă de ARN care poate fi apoi amplificată.
• PCR și RT-PCR sunt, de obicei, reacții finale, în timp ce qPCR și RT-qPCR utilizează cinetica vitezei de sinteză a produsului în timpul reacției PCR pentru a cuantifica cantitatea de șablon prezentă.
• Metodele mai noi, cum ar fi PCR digitală, asigură cuantificarea absolută a șablonului ADN inițial, în timp ce metode precum PCR izotermă reduc nevoia de echipamente scumpe pentru a oferi rezultate fiabile.

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică de biologie moleculară relativ simplă și utilizată pe scară largă pentru a amplifica și detecta secvențele de ADN și ARN.În comparație cu metodele tradiționale de clonare și amplificare a ADN-ului, care pot dura adesea zile, PCR necesită doar câteva ore.PCR este foarte sensibilă și necesită un șablon minim pentru detectarea și amplificarea secvențelor specifice.Metodele PCR de bază au avansat în continuare de la detectarea simplă a ADN și ARN.Mai jos, am oferit o prezentare generală a diferitelor metode PCR și a reactivilor pe care îi oferim la Enzo Life Sciences pentru nevoile dumneavoastră de cercetare.Ne propunem să ajutăm oamenii de știință să acceseze rapid reactivii PCR pentru a-i folosi în următorul lor proiect de cercetare!

PCR

Pentru PCR standard, tot ce aveți nevoie este o ADN polimerază, magneziu, nucleotide, primeri, șablonul ADN care urmează să fie amplificat și un termociclor.Mecanismul PCR este la fel de simplu ca și scopul său: 1) ADN-ul dublu catenar (dsDNA) este denaturat la căldură, 2) primerii se aliniază la catenele simple de ADN și 3) primerii sunt extinși de ADN polimerază, rezultând două copii ale ADN-ului. catenă originală de ADN.Procesul de denaturare, recoacere și alungire pe o serie de temperaturi și timpi este cunoscut ca un ciclu de amplificare (Fig. 1).

Fiecare pas al ciclului ar trebui să fie optimizat pentru șablonul și setul de amorse utilizate.Acest ciclu se repetă de aproximativ 20-40 de ori, iar produsul amplificat poate fi apoi analizat, de obicei prin gel de agaroză (Fig. 2).

Deoarece PCR este o metodă foarte sensibilă și sunt necesare volume foarte mici pentru reacții individuale, se recomandă prepararea unui amestec principal pentru mai multe reacții.Amestecul principal trebuie să fie bine amestecat și apoi împărțit după numărul de reacții, asigurându-se că fiecare reacție va conține aceeași cantitate de enzimă, dNTP și primeri.Mulți furnizori, cum ar fi Enzo Life Sciences, oferă și amestecuri PCR care conțin deja totul, cu excepția primerilor și a șablonului ADN.

Regiunile bogate în guanină/citozină (GC-bogate) reprezintă o provocare în tehnicile standard PCR.Secvențele bogate în GC sunt mai stabile decât secvențele cu conținut mai scăzut de GC.În plus, secvențele bogate în GC tind să formeze structuri secundare, cum ar fi bucle de ac de păr.Ca rezultat, catenele duble bogate în GC sunt greu de separat complet în timpul fazei de denaturare.În consecință, ADN polimeraza nu poate sintetiza noua catenă fără obstacole.O temperatură de denaturare mai mare poate îmbunătăți acest lucru, iar ajustările către o temperatură de recoacere mai mare și un timp de recoacere mai scurt pot preveni legarea nespecifică a primerilor bogați în GC.Reactivii suplimentari pot îmbunătăți amplificarea secvențelor bogate în GC.DMSO, glicerolul și betaina ajută la perturbarea structurilor secundare care sunt cauzate de interacțiunile GC și facilitează astfel separarea dublelor catene.

Hot Start PCR

Amplificarea nespecifică este o problemă care poate apărea în timpul PCR.Cele mai multe ADN polimeraze care sunt utilizate pentru PCR funcționează cel mai bine la temperaturi de aproximativ 68 ° C până la 72 ° C.Cu toate acestea, enzima poate fi activă și la temperaturi mai scăzute, deși într-un grad mai scăzut.La temperaturi mult sub temperatura de recoacere, primerii se pot lega nespecific și pot duce la amplificare nespecifică, chiar dacă reacția este stabilită pe gheață.Acest lucru poate fi prevenit prin utilizarea inhibitorilor de polimerază care se disociază de ADN polimerază numai odată ce este atinsă o anumită temperatură, de unde și termenul de PCR cu pornire la cald.Inhibitorul poate fi un anticorp care leagă polimeraza și se denaturează la temperatura de denaturare inițială (95°C de obicei).

Polimeraza de înaltă fidelitate

În timp ce ADN-polimerazele se amplifică destul de precis la secvența șablon originală, pot apărea greșeli în potrivirea nucleotidelor.Nepotrivirile în aplicații, cum ar fi clonarea, pot avea ca rezultat transcrieri trunchiate și proteine ​​traduse greșit sau inactive în aval.Pentru a evita aceste nepotriviri, polimerazele cu activitate de „corectură” au fost identificate și încorporate în fluxul de lucru.Prima polimerază de corectare, Pfu, a fost identificată în 1991 în Pyrococcus furiosus.Această enzimă Pfu are o activitate exonuclează de la 3’ la 5’.Pe măsură ce ADN-ul este amplificat, exonucleaza îndepărtează nucleotidele nepotrivite la capătul 3' al catenei.Nucleotida corectă este apoi înlocuită, iar sinteza ADN-ului continuă.Identificarea secvențelor de nucleotide incorecte se bazează pe afinitatea de legare pentru nucleozidul trifosfat corect cu enzima, unde legarea ineficientă încetinește sinteza și permite înlocuirea corectă.Activitatea de corectare a polimerazei Pfu are ca rezultat mai puține erori în secvența finală în comparație cu ADN polimeraza Taq.În ultimii ani, au fost identificate și alte enzime de corectare și au fost făcute modificări ale enzimei originale Pfu pentru a reduce și mai mult rata de eroare în timpul amplificării ADN-ului.

RT-PCR

PCR cu transcripție inversă, sau RT-PCR, permite utilizarea ARN ca șablon.O etapă suplimentară permite detectarea și amplificarea ARN-ului.ARN-ul este transcris invers în ADN complementar (ADNc), folosind transcriptază inversă.Calitatea și puritatea șablonului ARN sunt esențiale pentru succesul RT-PCR.Primul pas al RT-PCR este sinteza unui hibrid ADN/ARN.Reverse transcriptaza are, de asemenea, o funcție RNază H, care degradează porțiunea de ARN a hibridului.Molecula de ADN monocatenar este apoi completată de activitatea ADN-polimerazei dependentă de ADN a transcriptazei inverse în ADNc.Eficiența reacției cu prima catenă poate afecta procesul de amplificare.De aici înainte, procedura standard PCR este utilizată pentru a amplifica cADN-ul.Posibilitatea de a inversa ARN-ul în cADN prin RT-PCR are multe avantaje și este utilizat în principal pentru analiza expresiei genelor.ARN-ul este monocatenar și foarte instabil, ceea ce îl face dificil de lucrat.Acesta servește de obicei ca prim pas în qPCR, care cuantifică transcrierile de ARN într-o probă biologică.

qPCR și RT-qPCR

PCR cantitativ (qPCR) este utilizat pentru detectarea, caracterizarea și cuantificarea acizilor nucleici pentru numeroase aplicații.În RT-qPCR, transcrierile de ARN sunt adesea cuantificate prin transcrierea lor inversă în cADN mai întâi, așa cum este descris mai sus, și apoi qPCR este efectuat ulterior.Ca și în PCR standard, ADN-ul este amplificat prin trei etape repetate: denaturare, recoacere și alungire.Cu toate acestea, în qPCR, etichetarea fluorescentă permite colectarea de date pe măsură ce PCR progresează.Această tehnică are multe beneficii datorită gamei de metode și chimie disponibile.

În qPCR pe bază de colorant (de obicei verde), etichetarea fluorescentă permite cuantificarea moleculelor de ADN amplificate prin utilizarea unui colorant de legare dsDNA.În timpul fiecărui ciclu, se măsoară fluorescența.Semnalul de fluorescență crește proporțional cu cantitatea de ADN replicat.Prin urmare, ADN-ul este cuantificat în „timp real” (Fig. 3).Dezavantajele qPCR pe bază de colorant sunt că doar o țintă poate fi examinată la un moment dat și că colorantul se va lega de orice ds-ADN prezent în probă.

În qPCR bazat pe sondă, multe ținte pot fi detectate simultan în fiecare probă, dar acest lucru necesită optimizarea și proiectarea unei probe specifice țintei utilizate în plus față de primeri.Sunt disponibile mai multe tipuri de modele de sonde, dar cel mai comun tip este o sondă de hidroliză, care încorporează un fluorofor și un extinctor.Transferul de energie prin rezonanță de fluorescență (FRET) previne emisia fluoroforului prin extindere în timp ce sonda este intactă.Cu toate acestea, în timpul reacției PCR, sonda este hidrolizată în timpul extinderii primerului și amplificării secvenței specifice la care este legată.Clivajul sondei separă fluoroforul de stingător și are ca rezultat o creștere dependentă de amplificare a fluorescenței (Fig. 4).Astfel, semnalul de fluorescență dintr-o reacție qPCR bazată pe sondă este proporțional cu cantitatea de secvență țintă a sondei prezentă în probă.Deoarece qPCR pe bază de sondă este mai specific decât qPCR pe bază de colorant, este adesea tehnologia utilizată în testele de diagnosticare bazate pe qPCR.

Amplificare izotermă

Tehnicile PCR menționate mai sus necesită echipamente scumpe de termociclare pentru a crește și scădea cu precizie temperaturile camerei pentru etapele de denaturare, recoacere și extindere.Au fost dezvoltate o serie de tehnici care nu au nevoie de dispozitive atât de precise și pot fi efectuate într-o simplă baie de apă sau chiar în interiorul celulelor de interes.Aceste tehnici sunt numite colectiv amplificare izotermă și funcționează bazat pe amplificare exponențială, liniară sau în cascadă.

Cel mai cunoscut tip de amplificare izotermă este amplificarea izotermă mediată de buclă sau LAMP.LAMP folosește amplificarea exponențială la 65⁰C pentru a amplifica ADN-ul sau ARN-ul matriță.Când se efectuează LAMP, patru până la șase primeri complementari cu regiunile ADN-ului țintă sunt utilizați cu o ADN polimerază pentru a sintetiza ADN nou.Doi dintre acești primeri au secvențe complementare care recunosc secvențele din ceilalți primeri și le leagă, permițând formarea unei structuri de „buclă” în ADN-ul nou sintetizat, care apoi ajută la recoacere primerului în rundele ulterioare de amplificare.LAMPA poate fi vizualizată prin mai multe metode, inclusiv fluorescență, electroforeză pe gel de agaroză sau colorimetrie.Ușurința de a vizualiza și detecta prezența sau absența produsului prin colorimetrie și lipsa echipamentelor costisitoare necesare au făcut din LAMP o opțiune potrivită pentru testarea SARS-CoV-2 în zonele în care testarea clinică de laborator nu era ușor disponibilă sau depozitarea și transportul probelor. nu a fost fezabilă sau în laboratoare care nu aveau anterior echipamente de termociclare PCR.