Baza de proiectare a amorsei (99% probleme pot fi rezolvate)
1. Lungimea primerului: manualul necesită 15-30 bp, de obicei aproximativ 20 bp.Starea reală este mai bine să fie de 18-24 pb pentru a asigura specificitatea, dar cu cât este mai lung, cu atât grundul mai bun, prea lung va reduce, de asemenea, specificitatea și va reduce randamentul.
2. Intervalul de amplificare a primerului: 200-500bp este adecvat, iar fragmentul poate fi extins la 10kb în condiții specifice.
3. Primer de bază: Conținutul de G+C ar trebui să fie de 40-60%, prea puțin efect de amplificare G+C nu este bun, prea mult G+C este ușor să apară benzi nespecifice.ATGC este cel mai bine distribuit aleatoriu, evitând grupurile de mai mult de 5 nucleotide purinice sau pirimidinice.Multi-gc pentru capătul 5′ și secvențele intermediare pentru a crește stabilitatea, evitați GC bogat la capătul 3′, fără GC pentru ultimele 3 baze sau fără GC pentru 3 din ultimele 5 baze.
4. Evitați structura secundară în primeri și evitați complementarea între doi primeri, în special complementarea la capătul 3', altfel se va forma dimer de primer și se vor genera benzi amplificate nespecifice.
5. Bazele de la capătul 3' al primerilor, în special ultimele și penultima baze, ar trebui să fie strict împerecheate pentru a evita eșecul PCR din cauza bazelor terminale nepereche.
6. Primerii au sau pot fi adăugați cu situsuri de scindare adecvate, iar secvența țintă amplificată ar trebui să aibă, de preferință, situsuri de scindare adecvate, ceea ce este foarte benefic pentru analiza de scindare sau donarea moleculară.
7. Specificitatea primerilor: primerii nu ar trebui să aibă omologie evidentă cu alte secvențe din baza de date de secvențe de acid nucleic.
8. Învață să folosești software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Acest design online funcționează cel mai bine).
Conținutul de mai sus poate rezolva cel puțin 99% din problemele de proiectare a grundului.
Controlați detaliile designului grundului
1. Lungimea grundului
Lungimea generală a grundului este de 18 ~ 30 de baze.În general, cel mai important factor care determină temperatura de recoacere a grundului este lungimea grundului.Temperatura de recoacere a grundului este în general selectată (valoarea Tm -5℃), iar unele folosesc direct valoarea Tm.Următoarele formule pot fi utilizate pentru a calcula aproximativ temperatura de recoacere a primerilor.
Când lungimea grundului este mai mică de 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Când lungimea grundului este mai mare de 20bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/lungime-5℃
În plus, multe programe pot fi utilizate și pentru a calcula temperatura de recoacere, principiul de calcul va fi diferit, așa că uneori valoarea calculată poate avea un mic decalaj.Pentru a optimiza reacțiile PCR, cei mai scurti primeri care asigură temperaturi de recoacere nu mai mici de 54℃ sunt utilizați pentru cea mai bună eficiență și specificitate.
În general, specificitatea primerului crește cu un factor de patru pentru fiecare nucleotidă suplimentară, astfel încât lungimea minimă a primerului pentru majoritatea aplicațiilor este de 18 nucleotide.Limita superioară a lungimii primerului nu este foarte importantă, în principal legată de eficiența reacției.Din cauza entropiei, cu cât primerul este mai lung, cu atât este mai mică viteza la care se recoacă pentru a se lega de ADN-ul țintă pentru a forma un șablon stabil dublu catenar pentru legarea ADN-polimerazei.
Când se utilizează software pentru a proiecta primeri, lungimea primerilor poate fi determinată la rândul său după valoarea TM, în special pentru primerii de PCR cantitativ cu fluorescență, TM=60℃ sau cam asa ceva ar trebui controlat.
2.Conținutul GC
În general, conținutul de G+C în secvențele de primeri este de 40% ~ 60%, iar conținutul GC și valoarea Tm a unei perechi de primeri trebuie coordonate.Dacă primerul are o tendință serioasă de GC sau AT, se poate adăuga o cantitate adecvată de coadă A, T sau G și C la capătul 5' al primerului.
3. Temperatura de recoacere
Temperatura de recoacere ar trebui să fie cu 5℃ mai mică decât temperatura de deblocare.Dacă numărul de baze de primer este mic, temperatura de recoacere poate fi crescută în mod corespunzător, ceea ce poate crește specificitatea PCR.Dacă numărul de baze este mare, temperatura de recoacere poate fi redusă în mod corespunzător.Diferența de temperatură de recoacere dintre o pereche de primeri de 4℃ ~ 6℃ nu va afecta randamentul PCR, dar în mod ideal temperatura de recoacere a unei perechi de primeri este aceeași, care poate varia între 55℃ ~ 75℃.
4. Evitați zona structurii secundare a șablonului de amplificare
Cel mai bine este să evitați regiunea structurii secundare a șablonului atunci când selectați fragmentul amplificat.Structura secundară stabilă a fragmentului țintă poate fi prezisă și estimată de software-ul de calculator relevant, care este util pentru selectarea șablonului.Rezultatele experimentale arată că expansiunea este adesea nereușită atunci când energia liberă (△G) a regiunii care trebuie extinsă este mai mică de 58,6 lkJ/mol.
5. Nepotrivire cu ADN-ul țintă
Atunci când secvența de ADN țintă amplificată este mare, un primer se poate lega de mai multe părți ale ADN-ului țintă, rezultând mai multe benzi care apar în rezultat.De data aceasta este necesar să utilizați testarea software-ului BLAST, site-ul web:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Selectați Aliniați două secvențe (bl2seq).
Lipirea secvențelor de primer în zona 1 și a secvențelor de ADN țintă în zona 2 este interschimbabilă, iar BLAST calculează posibilități complementare, antisens și alte posibilități, astfel încât utilizatorii nu trebuie să observe dacă ambele lanțuri sunt lanțuri senzoriale.De asemenea, puteți introduce numărul GI dacă cunoașteți numărul GI al secvenței în baza de date, astfel încât să nu trebuie să lipiți o secțiune mare a secvenței.În cele din urmă, faceți clic pe Aliniere la 3 pentru a vedea dacă primerul are mai multe locuri omoloage în ADN-ul țintă.
6. Terminal de amorsare
Capătul 3 al grundului este locul în care începe extensia, deci este important să preveniți nepotrivirile să înceapă acolo.Capătul 3' nu trebuie să fie mai mult de 3 G sau C consecutiv, deoarece acest lucru va face ca primerul să fie declanșat în mod greșit în regiunea secvenței de îmbogățire G+C.Capătul 3' nu poate forma nicio structură secundară, cu excepția reacțiilor speciale PCR (AS-PCR), capătul 3' al primerului nu poate fi nepotrivit.De exemplu, dacă regiunea de codificare este amplificată, capătul 3' al primerului nu ar trebui să fie terminat la poziţia a treia a codonului, deoarece poziţia a treia a codonului este predispusă la degenerare, ceea ce va afecta specificitatea şi eficienţa amplificării.Când utilizați primeri de anexare, consultați tabelul de utilizare a codonilor, acordați atenție preferințelor biologice, nu utilizați primeri de anexare la capătul 3′ și utilizați o concentrație mai mare de primeri (1uM-3uM).
7. Structura secundară a primerilor
Primerii înșiși nu ar trebui să aibă secvențe complementare, altfel primerii înșiși se vor plia în structuri în ac de păr, iar această structură secundară va afecta legarea primerilor și șablonelor din cauza obstacolelor sterice.Dacă se folosește judecata artificială, bazele complementare continue ale primerilor înșiși nu trebuie să fie mai mari de 3 pb.Nu ar trebui să existe complementaritate între cei doi primeri, în special suprapunerea complementară a capătului 3' trebuie evitată pentru a preveni formarea dimerilor de primer.În general, nu ar trebui să existe mai mult de 4 baze consecutive de omologie sau complementaritate între o pereche de primeri.
8. Adăugați markeri sau loci
Capătul 5 are un efect redus asupra specificității de amplificare și, prin urmare, poate fi modificat fără a afecta specificitatea de amplificare.Modificarea capacului 5 al primerului a inclus: adăugarea situsului de restricţie a enzimei;Biotină marcată, fluorescență, digoxină, Eu3+ etc. Introduceți secvențe de ADN de legare la proteine;Introducerea situsurilor de mutație, inserarea și lipsa secvențelor de mutație și introducerea secvențelor promotoare etc. Bazele suplimentare vor afecta mai mult sau mai puțin eficiența amplificării și vor crește șansa formării dimerului de primer, dar trebuie făcute unele concesii pentru următorul pas.Secvențe suplimentare care nu există pe secvența țintă, cum ar fi situsurile de restricție și secvențele promotorului, pot fi adăugate la capătul 5′ al primerului fără a afecta specificitatea.Aceste secvențe nu sunt incluse în calculul valorilor Tm primerului, dar ar trebui testate pentru complementaritate și structura secundară internă.
9. Subclone
De cele mai multe ori, PCR este doar o clonare preliminară și apoi trebuie să subclonăm fragmentul țintă în diverși vectori, așa că trebuie să proiectăm baze suplimentare pentru următoarea operație din etapa PCR.
Unele secvențe concepute pentru subclonare sunt rezumate mai jos.
S-a adăugat situsul de restricţie al endonucleazei de restricţie
Adăugarea de situsuri de restricție enzimatică este metoda cea mai frecvent utilizată pentru subclonarea produselor PCR.În general, locul de clivaj este de șase baze, în plus față de capătul 5 'al site-ului de clivaj trebuie să adăugați 2 ~ 3 baze de protecție.Cu toate acestea, numărul de baze protectoare necesare diferitelor enzime este diferit.De exemplu, SalⅠ nu necesită nicio bază de protecție, EcoRⅤ necesită 1 bază de protecție, NotⅠ necesită 2 baze de protecție și Hind Ⅲ necesită 3 baze de protecție.
LIC adaugă coada
Numele complet al LIC este Ligation-Independent Cloning, o metodă de clonare inventată de Navogen special pentru partea sa din vectorul pET.Purtătorul de pET preparat prin metoda LIC are capete necomplementare de 12-15 baze simple lipicioase, care completează capetele lipicioase corespunzătoare de pe fragmentul de inserție țintă.În scopuri de amplificare, secvența primerului 5′ a fragmentului inserat ar trebui să completeze vectorul LIC.Activitatea de extracție 3′→5′ a ADN polimerazei T4 poate forma un capăt lipicios cu o singură catenă pe fragmentul inserat după un timp scurt.Deoarece produsul poate fi format numai din recoacere reciprocă a fragmentului de inserție preparat și a vectorului, această metodă este foarte rapidă și eficientă și este donarea direcționată.
Clona TA direcționată adaugă coada
Clonarea TA nu a putut ținti fragmentul într-un vector, așa că mai târziu Invitrogen a introdus un vector care ar putea viza clonarea, care conținea patru GTGGS de bază proeminente la un capăt.Prin urmare, în proiectarea primerilor PCR, secvențele complementare ar trebui adăugate în consecință, astfel încât fragmentele să poată fi „orientate”.
Dacă aveți puțin timp, puteți încerca sinteza directă, combinând gena cu vectorul, ceea ce numim sinteza genei ET la musculiști.
D. Metoda de clonare In-Fusion
Nu este necesară ligază, nu este necesară o reacție lungă.Atâta timp cât o secvență la ambele capete ale vectorului linearizat este introdusă în proiectarea primerilor, apoi produsul PCR și vectorul linearizat sunt adăugate în soluția de enzimă de perfuzie care conține BSA și plasate la temperatura camerei timp de o jumătate de oră, transformarea poate fi efectuată.Această metodă este potrivită în special pentru conversia de volum mare.
10. Îmbina grundul
Uneori, despre proiectarea primerului se cunosc doar informații limitate de secvență.De exemplu, dacă numai secvența de aminoacizi este cunoscută, primerul de fuziune poate fi proiectat.Un primer de fuziune este un amestec de secvențe diferite care reprezintă toate posibilitățile diferite de bază care codifică un singur aminoacid.Pentru a crește specificitatea, puteți consulta tabelul de utilizare a codonilor pentru a reduce anexarea în funcție de preferințele de utilizare de bază ale diferitelor organisme.Hipoxantina poate fi asociată cu toate bazele pentru a reduce temperatura de recoacere a grundului.Nu utilizați bazele anexate la capătul 3′ al primerului deoarece recoacere a ultimelor 3 baze la capătul 3′ este suficientă pentru a iniția PCR la locul greșit.Sunt utilizate concentrații mai mari de primer (1μM până la 3μM), deoarece primerii din multe amestecuri de anexare nu sunt specifici șablonului țintă.
materii prime PCRControl
1. Cantitatea de grund
Concentrația fiecărui primer este de 0,1 ~ 1 umol sau 10 ~ 100 pmol.Este mai bine să obțineți rezultatul dorit cu cea mai mică cantitate de grund.Concentrația mare de primer va cauza nepotrivire și amplificare nespecifică și va crește șansa de a forma dimeri între primeri.
2. Concentrarea primerului
Concentrația primerilor afectează specificitatea.Concentrația optimă a primerului este în general între 0,1 și 0,5μM.Concentrațiile mai mari de primer conduc la amplificarea produselor nespecifice.
3. Temperatura de recoacere a grundului
Un alt parametru important pentru grunduri este temperatura de topire (Tm).Aceasta este temperatura când 50% dintre primeri și secvențele complementare sunt reprezentate ca molecule de ADN dublu catenar.Tm este necesar pentru a seta temperatura de recoacere PCR.În mod ideal, temperatura de recoacere este suficient de scăzută pentru a asigura o recoacere eficientă a primerilor cu secvența țintă, dar suficient de mare pentru a reduce legarea nespecifică.Temperatura de recoacere rezonabilă de la 55℃ la 70℃.Temperatura de recoacere este, în general, setată cu 5℃ mai mică decât Tm de grund.
Există mai multe formule pentru stabilirea Tm, care variază foarte mult în funcție de formula utilizată și de secvența primerilor.Deoarece majoritatea formulelor oferă o valoare estimată a Tm, toate temperaturile de recoacere sunt doar un punct de plecare.Specificitatea poate fi îmbunătățită prin analiza mai multor reacții care ridică progresiv temperatura de recoacere.Începeți sub valoarea Tm-5℃ estimată și creșteți treptat temperatura de recoacere cu o creștere de 2℃.O temperatură mai mare de recoacere va reduce formarea dimerilor de grund și a produselor nespecifice.Pentru cele mai bune rezultate, cei doi primeri ar trebui să aibă valori Tm aproximative.Dacă diferența Tm a perechilor de primeri este mai mare de 5℃, primerii vor prezenta o pornire falsă semnificativă prin utilizarea unei temperaturi de recoacere mai scăzute în ciclu.Dacă cei doi primeri Tm sunt diferiți, setați temperatura de recoacere la 5℃ mai mică decât cea mai mică Tm.Alternativ, pentru a crește specificitatea, cinci cicluri pot fi efectuate mai întâi la temperaturi de recoacere proiectate pentru Tm mai mare, urmate de ciclurile rămase la temperaturi de recoacere proiectate pentru Tm mai scăzută.Acest lucru permite obținerea unei copii parțiale a șablonului de destinație în condiții dificile.
4. Puritatea și stabilitatea primerului
Puritatea standard a primerilor personalizați este adecvată pentru majoritatea aplicațiilor PCR.Îndepărtarea grupărilor benzoil și izobutilil prin desalare este minimă și, prin urmare, nu interferează cu PCR.Unele aplicații necesită purificare pentru a elimina orice secvențe care nu sunt de lungime completă din procesul de sinteză.Aceste secvențe trunchiate apar deoarece eficiența chimiei sintezei ADN nu este de 100%.Acesta este un proces circular care utilizează reacții chimice repetate pe măsură ce fiecare bază este adăugată pentru a face ADN de la 3′ la 5′.Puteți eșua în oricare ciclu.Primerii mai lungi, în special cei mai mari de 50 de baze, au o proporție mare de secvențe trunchiate și pot necesita purificare.
Randamentul primerilor este afectat de eficiența chimiei sintetice și a metodei de purificare.Companiile biofarmaceutice, cum ar fi Cytology și Shengong, folosesc toate o unitate OD minimă pentru a asigura producția totală de oligonucleozide.Grundule personalizate sunt livrate sub formă de pulbere uscată.Cel mai bine este să redizolvați primerii în TE, astfel încât concentrația finală să fie de 100μM.TE este mai bun decât apa deionizată deoarece pH-ul apei este adesea acid și va provoca hidroliza oligonucleozidelor.
Stabilitatea grundurilor depinde de condițiile de depozitare.Pulberea uscată și amorsele dizolvate trebuie depozitate la -20℃.Primerii dizolvați în TE la concentrații mai mari de 10μM pot fi păstrați stabil la -20℃ timp de 6 luni, dar pot fi păstrați doar la temperatura camerei (15℃ până la 30℃) pentru mai puțin de 1 săptămână.Grundurile uscate cu pulbere pot fi păstrate la -20 C timp de cel puțin 1 an și la temperatura camerei (15 C până la 30 C) până la 2 luni.
5. Enzimele și concentrațiile lor
În prezent, ADN polimeraza Taq utilizată este practic enzima de inginerie genetică sintetizată de bacteriile coliforme.Cantitatea de enzimă necesară pentru catalizarea unei reacții PCR tipice este de aproximativ 2,5 U (se referă la volumul total de reacție de 100 ul).Dacă concentrația este prea mare, poate duce la amplificare nespecifică;dacă concentrația este prea mică, cantitatea de produs sintetic va fi redusă.
6. Calitatea și concentrația dNTP
Calitatea dNTP este strâns legată de concentrația și eficiența amplificării PCR.Pulberea de dNTP este granulară, iar variabilitatea sa își pierde activitatea biologică dacă este depozitată necorespunzător.Soluția dNTP este acidă și trebuie utilizată în concentrație mare, cu soluție tampon 1M NaOH sau 1M Tris.HCL pentru a-și ajusta PH-ul la 7,0 ~ 7,5, cantitate mică de subambalaj, depozitare congelată la -20℃.Înghețarea-dezghețarea multiplă va degrada dNTP.În reacția PCR, dNTP ar trebui să fie de 50 ~ 200 umol/L.În special, ar trebui să se acorde atenție concentrației celor patru DNTPS care trebuie să fie egale (prepararea molelor egale).Dacă concentrația unuia dintre ele este diferită de celelalte (mai mare sau mai mică), se va produce nepotrivire.Concentrația prea scăzută va reduce randamentul produselor PCR.dNTP se poate combina cu Mg2+ și reduce concentrația de Mg2+ liber.
7. Acid nucleic șablon (genă țintă).
Cantitatea și gradul de purificare a acidului nucleic șablon este una dintre verigile cheie pentru succesul sau eșecul PCR.Metodele tradiționale de purificare a ADN-ului folosesc de obicei SDS și proteaza K pentru a digera și elimina specimenele.Principalele funcții ale SDS sunt: dizolva lipidele și proteinele de pe membrana celulară, distrugând astfel membrana celulară prin dizolvarea proteinelor membranare și disocierea proteinelor nucleare în celulă, SDS se poate combina și cu proteinele și precipita;Proteaza K poate hidroliza și digera proteinele, în special histonele legate cu ADN, și apoi poate folosi solvent organic fenol și cloroform pentru a extrage proteinele și alte componente celulare și poate folosi etanol sau alcool izopropilic pentru a precipita acidul nucleic.Acidul nucleic extras poate fi utilizat ca matriță pentru reacțiile PCR.Pentru probele de detecție clinică generală, o metodă rapidă și simplă poate fi utilizată pentru a dizolva celulele, a lizat agenții patogeni, a digera și a elimina proteinele din cromozomi pentru a elibera genele țintă și utilizată direct pentru amplificarea PCR.Extracția șablonului de ARN utilizează de obicei metoda izotiocianat de guanidină sau protează K pentru a preveni degradarea ARN-ului de RNază.
8.Concentrația de Mg2+
Mg2+ are un efect semnificativ asupra specificității și randamentului amplificării PCR.În general, reacția PCR, când concentrația diferitelor dNTP este de 200 umol/L, concentrația adecvată de Mg2+ este de 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Concentrația de Mg2+ este prea mare, specificitatea reacției scade, are loc amplificarea nespecifică, concentrația prea scăzută va reduce activitatea ADN polimerazei Taq, ducând la reducerea produșilor de reacție.
Ionii de magneziu afectează mai multe aspecte ale PCR, cum ar fi activitatea ADN polimerazei, care afectează randamentul;Un alt exemplu este recoacerea primerului, care afectează specificitatea.dNTP și șablonul se leagă de ionul de magneziu, reducând cantitatea de ion de magneziu liber necesară pentru activitatea enzimatică.Concentrația optimă de ioni de magneziu variază pentru diferite perechi de primeri și șabloane, dar o concentrație de pornire PCR tipică cu 200μM dNTP este de 1,5 mM (notă: pentru PCR cantitativă în timp real, utilizați soluție de ioni de magneziu de 3 până la 5 mM cu o sondă fluorescentă).Concentrațiile mai mari de ioni de magneziu liberi cresc randamentul, dar cresc și amplificarea nespecifică și scad fidelitatea.Pentru a determina concentrația optimă, titrarile ionilor de magneziu au fost efectuate în trepte de 0,5 mM de la 1 mM la 3 mM.Pentru a reduce dependența de optimizarea ionilor de magneziu, poate fi utilizată ADN polimeraza Platinum Taq.Platinum Taq DNA polimeraza este capabilă să mențină funcția într-un interval mai larg de concentrații de ioni de magneziu decât Taq DNA polimeraza și, prin urmare, necesită mai puțină optimizare.
9. Aditivi care promovează PCR
Optimizarea temperaturii de recoacere, a designului primerului și a concentrației ionilor de magneziu este suficientă pentru amplificarea foarte specifică a majorității șabloanelor;cu toate acestea, unele șabloane, inclusiv cele cu conținut ridicat de GC, necesită măsuri suplimentare.Aditivii care afectează temperatura de topire a ADN-ului oferă o altă modalitate de a îmbunătăți specificitatea produsului și randamentul.Este necesară denaturarea completă a șablonului pentru cele mai bune rezultate.
În plus, structura secundară previne legarea primerului și extinderea enzimei.
Aditivii PCR, inclusiv formamidă, DMSO, glicerină, betaină și PCRx Enhancer Solution, îmbunătățesc amplificarea.Mecanismul lor posibil este de a reduce temperatura de topire, ajutând astfel la recoacere a primerilor și ajutând extinderea ADN polimerazei prin regiunea structurii secundare.Soluția PCRx are alte avantaje.Optimizarea minimă a ionilor de magneziu este necesară atunci când este utilizat cu ADN polimerază Platinum Taq și ADN polimerază Platinum Pfx.Astfel, tehnica Platinum este combinată cu aditivul pentru a crește specificitatea, reducând în același timp dependența celei de-a treia abordări, optimizarea ionilor de magneziu.Pentru cele mai bune rezultate, concentrația de aditivi ar trebui optimizată, în special DMSO, formamidă și glicerol, care inhibă ADN polimeraza Taq.
10. Pornire la cald
PCR cu pornire la cald este una dintre cele mai importante metode de îmbunătățire a specificității PCR pe lângă designul bun al primerului.Deși temperatura optimă de alungire a ADN polimerazei Taq este de 72 ℃, polimeraza rămâne activă la temperatura camerei.Astfel, se produc produse nespecifice atunci când temperatura de menținere este mai mică decât temperatura de recoacere în timpul pregătirii reacției PCR și la începutul ciclului termic.Odată formate, aceste produse nespecifice sunt amplificate efectiv.PCR cu pornire la cald este deosebit de eficientă atunci când situsurile utilizate pentru proiectarea primerului sunt limitate de locația elementelor genetice, cum ar fi mutațiile direcționate pe site, clonarea expresiei sau construirea și manipularea elementelor genetice utilizate pentru ingineria ADN-ului.
O metodă obișnuită de a limita activitatea ADN polimerazei Taq este prepararea soluției de reacție PCR pe gheață și plasarea acesteia într-un aparat PCR preîncălzit.Această metodă este simplă și ieftină, dar nu completează activitatea enzimei și, prin urmare, nu elimină complet amplificarea produselor nespecifice.
Amorsarea termică întârzie sinteza ADN prin inhibarea unei componente esențiale până când aparatul PCR atinge temperatura de denaturare.Majoritatea metodelor manuale de inițiere termică, inclusiv adăugarea întârziată a polimerazei Taq ADN, sunt greoaie, în special pentru aplicațiile cu randament ridicat.Alte metode de amorsare termică folosesc un scut de ceară pentru a cuprinde o componentă esențială, inclusiv ioni de magneziu sau enzime, sau pentru a izola fizic componentele reactive, cum ar fi șabloanele și tampoanele.În timpul ciclului termic, diferitele componente sunt eliberate și amestecate împreună pe măsură ce ceara se topește.La fel ca metoda manuală de pornire la cald, metoda cu scut de ceară este greoaie și predispusă la contaminare și nu este potrivită pentru aplicații cu randament ridicat.
ADN-polimeraza de platină este convenabilă și eficientă pentru PCR cu pornire automată la cald.ADN polimeraza Taq platină constă din ADN polimerază Taq recombinată combinată cu anticorp monoclonal împotriva ADN polimerazei Taq.Anticorpii sunt formulați prin PCR pentru a inhiba activitatea enzimatică în timpul menținerii prelungite a temperaturii.Taq ADN polimeraza a fost eliberată în reacție în timpul izolației la 94℃ a etapei de denaturare, restabilind activitatea completă a polimerazei.Spre deosebire de ADN polimeraza Taq modificată chimic pentru inițierea termică, enzima platină nu necesită izolație prelungită la 94℃ (10 până la 15 minute) pentru a activa polimeraza.Cu ADN-polimeraza PlatinumTaq, 90% din activitatea ADN-polimerazei Taq a fost restabilită după 2 minute la 94℃.
11. Nest-PCR
Rundele succesive de amplificare folosind primeri imbricați pot îmbunătăți specificitatea și sensibilitatea.Prima rundă este o amplificare standard de 15 până la 20 de cicluri.O mică fracțiune din produsul de amplificare inițial a fost diluată de 100 până la 1000 de ori și adăugată la a doua rundă de amplificare timp de 15 până la 20 de cicluri.Alternativ, produsul amplificat inițial poate fi dimensionat prin purificare cu gel.Un primer imbricat este utilizat în a doua rundă de amplificare, care se poate lega la secvența țintă din interiorul primului primer.Utilizarea PCR imbricată reduce posibilitatea de amplificare a mai multor situsuri țintă deoarece există puține secvențe țintă complementare ambelor seturi de primeri.Același număr total de cicluri (30 până la 40) cu aceiași primeri a amplificat situsurile nespecifice.PCR imbricată crește sensibilitatea secvențelor țintă limitate (de exemplu, mrna rare) și îmbunătățește specificitatea PCRS dificile (de exemplu 5′ RACE).
12. PCR descendent
PCR descendent îmbunătățește specificitatea prin utilizarea condițiilor de recoacere strânse pentru primele câteva cicluri de PCR.Ciclul începe la o temperatură de recoacere cu aproximativ 5℃ mai mare decât Tm estimată, apoi fiecare ciclu este redus cu 1℃ la 2℃ până când temperatura de recoacere este sub Tm 5℃.Doar șablonul destinație cu cea mai mare omologie va fi amplificat.Aceste produse continuă să se extindă în ciclurile ulterioare, excluzând produsele nespecifice amplificate.PCR descendentă este utilă pentru metodele în care nu este cunoscut gradul de omologie între primer și șablonul țintă, cum ar fi amprentarea ADN-ului AFLP.
Truse PCR aferente
Eroul PCR 2×TMSistemul Mix are o toleranță mai mare la inhibitorii PCR decât sistemul obișnuit PCR Mix și poate face față cu ușurință amplificării PCR a diferitelor șabloane complexe.Sistemul de reacție unic și Taq Hero de înaltă eficiență fac ca reacția PCR să aibă o eficiență, specificitate și sensibilitate mai mari de amplificare.
Eficiență mai mare de amplificare
Are activitate ADN polimerază 5'→3' și activitate exonuclează 5'→3', fără activitate exonuclează 3'→5'.
Kit PCR în timp real Easyᵀᴹ-SYBR Green I
Specific — tamponul optimizat și enzima Taq cu pornire la cald pot preveni amplificarea nespecifică și formarea dimerului de primer
Sensibilitate ridicată—poate detecta copii reduse ale șablonului
Setul folosește un reactiv unic de transcripție inversă Foregene și Foregene HotStar Taq DNA Polymerase combinate cu un sistem de reacție unic pentru a îmbunătăți eficient eficiența amplificării și specificitatea reacției.
Ora postării: mai-09-2023
