Fără semnale de amplificare

1. Taq DNA Polymerase din kit își pierde activitatea din cauza depozitării necorespunzătoare sau a expirării trusei.
Recomandare: Confirmați condițiile de depozitare a trusei;re-adăugați o cantitate adecvată de Taq ADN polimerază la sistemul PCR sau cumpărați un nou kit de PCR în timp real pentru experimente conexe.

2. Există o mulțime de inhibitori ai ADN polimerazei Taq în șablonul ADN.
Sugestie: Repurificați șablonul sau reduceți cantitatea de șablon folosită.

3.Concentrația de Mg2+ nu este adecvată.
Recomandare: Concentrația de Mg2+ a amestecului 2× Real PCR pe care îl oferim este de 3,5 mM.Cu toate acestea, pentru unii primeri și șabloane speciali, concentrația de Mg2+ poate fi mai mare.Prin urmare, puteți adăuga direct MgCl2 pentru a optimiza concentrația de Mg2+.Se recomandă creșterea Mg2+ cu 0,5 mM de fiecare dată pentru optimizare.

4. Condițiile de amplificare PCR nu sunt adecvate, iar secvența sau concentrația primerului este necorespunzătoare.
Sugestie: confirmați corectitudinea secvenței primerului și primerul nu a fost degradat;dacă semnalul de amplificare nu este bun, încercați să reduceți temperatura de recoacere și să reglați concentrația primerului în mod corespunzător.

5. Cantitatea de șablon este prea mică sau prea mare.
Recomandare: Efectuați diluția gradientului de liniarizare a șablonului și selectați concentrația șablonului cu cel mai bun efect PCR pentru experimentul PCR în timp real.

NTC are o valoare prea mare a fluorescenței

1.Contaminarea cu reactiv cauzată în timpul funcționării.
Recomandare: Înlocuiți cu reactivi noi pentru experimentele PCR în timp real.

2.Contaminarea a avut loc în timpul pregătirii sistemului de reacție PCR.
Recomandare: Luați măsurile de protecție necesare în timpul funcționării, cum ar fi: purtarea mănușilor din latex, utilizarea unui vârf de pipetă cu filtru etc.

3. Primerii sunt degradați, iar degradarea primerilor va determina amplificare nespecifică.
Sugestie: Utilizați electroforeza SDS-PAGE pentru a detecta dacă primerii sunt degradați și înlocuiți-i cu primeri noi pentru experimentele PCR în timp real.

Primer dimer sau amplificare nespecifică

1.Concentrația de Mg2+ nu este adecvată.
Recomandare: Concentrația de Mg2+ a amestecului 2× Real PCR EasyTM pe care îl oferim este de 3,5 mM.Cu toate acestea, pentru unii primeri și șabloane speciali, concentrația de Mg2+ poate fi mai mare.Prin urmare, puteți adăuga direct MgCl2 pentru a optimiza concentrația de Mg2+.Se recomandă creșterea Mg2+ cu 0,5 mM de fiecare dată pentru optimizare.

2. Temperatura de recoacere PCR este prea scăzută.
Sugestie: Creșteți temperatura de recoacere PCR cu 1℃ sau 2℃ de fiecare dată.

3.Produsul PCR este prea lung.
Recomandare: lungimea produsului PCR în timp real ar trebui să fie între 100-150 bp, nu mai mult de 500 bp.

4.Primerii sunt degradați, iar degradarea primerilor va duce la apariția unei amplificări specifice.
Sugestie: Utilizați electroforeza SDS-PAGE pentru a detecta dacă primerii sunt degradați și înlocuiți-i cu primeri noi pentru experimentele PCR în timp real.

5. Sistemul PCR este necorespunzător sau sistemul este prea mic.
Sugestie: Sistemul de reacție PCR este prea mic va duce la scăderea preciziei de detecție.Cel mai bine este să utilizați sistemul de reacție recomandat de instrumentul PCR cantitativ pentru a relua experimentul PCR în timp real.

Repetabilitate slabă a valorilor cantitative

1. Instrumentul funcționează defectuos.
Sugestie: Pot exista erori între fiecare gaură PCR a instrumentului, ceea ce duce la reproductibilitate slabă în timpul gestionării sau detectării temperaturii.Vă rugăm să verificați conform instrucțiunilor instrumentului corespunzător.

2. Puritatea probei nu este bună.
Recomandare: Probele impure vor duce la reproductibilitatea slabă a experimentului, care include puritatea șablonului și a primerilor.Cel mai bine este să repurificați șablonul, iar primerii sunt cel mai bine purificați prin SDS-PAGE.

3. Timpul de pregătire și depozitare a sistemului PCR este prea lung.
Sugestie: Utilizați sistemul PCR în timp real pentru experimentul PCR imediat după pregătire și nu îl lăsați deoparte prea mult timp.

4. Condițiile de amplificare PCR nu sunt adecvate, iar secvența sau concentrația primerului este necorespunzătoare.
Sugestie: confirmați corectitudinea secvenței primerului și primerul nu a fost degradat;dacă semnalul de amplificare nu este bun, încercați să reduceți temperatura de recoacere și să reglați concentrația primerului în mod corespunzător.

5. Sistemul PCR este necorespunzător sau sistemul este prea mic.
Sugestie: Sistemul de reacție PCR este prea mic va duce la scăderea preciziei de detecție.Cel mai bine este să utilizați sistemul de reacție recomandat de instrumentul PCR cantitativ pentru a relua experimentul PCR în timp real.