Ghid de analiză a problemelor

Următoarea analiză a problemelor pe care le puteți întâlniTotal de planteRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

Coloana de rotație este înfundată

Blocarea coloanei de spin va face ca randamentul de ARN să fie redus sau chiar imposibil de purificat pentru a obține ARN, iar calitatea ARN-ului obținut va fi scăzută.

Analiza cauzei comune:

1. Proba nu este ruptă complet.

Fragmentarea incompletă a probei poate bloca coloana de curățare a ADN-ului, ceea ce poate afecta, de asemenea, randamentul și calitatea ARN.Vă recomandăm ca atunci când efectuați fragmentarea probei, să măcinați rapid în cantități suficiente de azot lichid pentru a rupe țesuturile, cum ar fi pereții celulari și membranele celulare ale probelor, cât mai mult posibil.Pentru mostrele de plante de polifenoli polizaharide, vă recomandăm să utilizați Plant Total ARN Isolation Kit Plus.

2.Aspirați supernatantul izolat din coloana de curățare ADN, aspirați peletul posibil de resturi celulare.

Peletul de resturi celulare aspirat poate înfunda coloana numai cu ARN în timpul procedurilor de adsorbție a ARN (vezi pasul 5 al procedurii, pasul 6 al procedurii polifenolilor polizaharide).Vă recomandăm să aveți grijă la aspirarea acestui supernatant pentru a evita aspirarea resturilor celulare.

3. Cantitatea inițială de probă este prea mare.

Utilizarea excesivă a probei va avea ca rezultat fragmentarea incompletă a probei sau liza incompletă a celulelor de către Buffer PRL1 sau Buffer PSL1, rezultând o coloană de purificare înfundată pentru operațiunile de purificare.Kitul de izolare a ARN total al plantei are un maxim inițial de 50 mg pentru fiecare purificare a unei probe operate.Pentru mostrele de plante de polifenoli polizaharide, vă recomandăm să încercați Kitul Plant Total ARN Isolation Kit Plus.

4. Temperatura centrifugei este prea scăzută.

Izolarea și purificarea întregului ARN, cu excepția distrugerii azotului lichid a țesutului probei, toate etapele sunt efectuate la temperatura camerei (20-25 °C).Unele centrifuge cu temperatură joasă au temperaturi sub 20 °C, ceea ce poate provoca blocări în coloana de curățare a ADN-ului și/sau coloana numai ARN.Dacă se întâmplă acest lucru, setați temperatura centrifugei la 20-25 °C și preîncălziți amestecul de liză și/sau adăugarea supernatantului de separare a etanolului la 37 °C.

Niciun ARN extras sau randamentul de ARN este scăzut

De obicei, există mulți factori care afectează eficiența recuperării, cum ar fi: conținutul de ARN al probei, metoda de operare, volumul de eluție etc.

Analiza cauzelor comune, după cum urmează:

1. În timpul operațiunii a fost efectuată o baie de gheață sau o centrifugare la temperatură joasă (4°C).

Sugestie: Operați la temperatura camerei (15-25°C) pe tot parcursul procesului, nu faceți baie de gheață și centrifugare la temperatură joasă.

       2.ARN-ul a fost degradat din cauza conservării necorespunzătoare a probei sau a conservării pe termen lung a probei.

Recomandare: Probele proaspăt colectate trebuie congelate rapid în azot lichid și apoi depozitate la -80 ° C pentru o perioadă lungă de timp, evitați înghețarea și dezghețarea repetată a probelor;sau imediat înmuiați probele în soluție de stabilizator de ARN RNAlater (probe de animale).

       3.Fragmentarea insuficientă a probei și liza duc la blocarea coloanei de purificare.

Sugestie: Când măcinați țesutul, vă rugăm să vă asigurați că țesutul este suficient de măcinat și transferați-l rapid în tamponul pre-preparat PSL1 (confirmați că a fost adăugată proporția corectă de β-ME, vezi pasul 1 al procedurii).

4. Eluentul a fost adăugat incorect.

Sugestie: Asigurați-vă că RNase-Free ddH₂O este picurată în mijlocul membranei coloanei de purificare.

5. Volumul corect de etanol absolut nu a fost adăugat la tamponul PSL2 sau tamponul PRW2.

Sugestie: Urmați instrucțiunile, adăugați volumul corect de etanol absolut în Buffer PSL2 și Buffer PRW2 și amestecați bine înainte de a utiliza kitul.

6. Cantitatea de probă de țesut este inadecvată.

Sugestie: Utilizați 50 mg de țesut la 500 μl de tampon PSL1.Utilizarea prea multă țesut va reduce cantitatea de ARN extras și puritatea ARN-ului rezultat va fi, de asemenea, redusă.Vă recomandăm insistent ca doza inițială a probei să nu depășească 50 mg per operațiune de extracție a ARN.

7. Volum de eluție inadecvat sau eluție incompletă.

Sugestie: Volumul de eluent al coloanei de purificare este de 50-200 μl;dacă efectul de eluție nu este satisfăcător, se recomandă prelungirea timpului la temperatura camerei după adăugarea ddH preîncălzită fără RNază₂O, cum ar fi 5-10 min.

8. Coloana de purificare are reziduuri de etanol după spălarea cu tampon PRW2.

   Sugestie: Dacă tubul gol este centrifugat timp de 1 min și mai rămâne etanol după spălare în tampon PRW2, puteți crește timpul de centrifugare a tubului gol la 2 minute sau puneți coloana de purificare la temperatura camerei timp de 5 minute pentru a elimina complet etanolul rezidual.

9.Setul a fost folosit incorect.

   Sugestie: pentru mostrele de plante de polizaharide polifenolice, este posibil ca utilizarea truselor obișnuite, cum ar fi Plant Total ARN Isolation Kit, să nu poată obține mostre de ARN ideale.Vă recomandăm să utilizați Plant Total ARN IsolationKit Plus, care este special conceput pentru mostrele de plante de polizaharide polifenolice.Un kit special dezvoltat pentru extragerea ARN-ului din probe de plante de polifenoli și polizaharide.

Valoarea OD260/OD280 este scăzută

Eluarea ARN cu ddH₂O și utilizat pentru citirea spectrofotometrului are ca rezultat valori scăzute ale OD260/OD280.Vă recomandăm să utilizați 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (în loc de ddH fără RNază)₂O pentru eluarea ARN) pentru a obține valori OD260/OD280 relativ corecte, consultați „Testele de concentrare și purificare a ARN” la pagina 19.

ARN-ul purificat este degradat

Calitatea ARN-ului purificat este legată de factori precum conservarea probei, contaminarea cu RNază și manipularea.

Analiza cauzelor comune:

1. Probele de țesut nu au fost depozitate la timp după colectare.

    Recomandare: Dacă probele de țesut nu sunt folosite la timp după colectare, vă rugăm să le păstrați imediat în azot lichid la temperatură scăzută sau să le transferați la -80°C pentru depozitare pe termen lung după congelare rapidă în azot lichid sau să scufundați imediat probele în soluție de stabilizator ARN RNAlater (probe de animale).Pentru extracția ARN, încercați să utilizați mostre de țesut proaspăt colectate.

2. Congelarea și decongelarea repetată a probelor de țesut.

   Sugestie: Când depozitați probe de țesut, cel mai bine este să le tăiați în bucăți mici pentru conservare și să scoateți o parte din ele atunci când le utilizați pentru a evita degradarea ARN-ului cauzată de înghețarea și dezghețarea repetată a probelor.

3.RNaza se introduce în sala de operație sau nu se poartă mănuși de unică folosință, măști etc.

   Sugestie: Experimentele de extracție a ARN sunt cel mai bine efectuate în operațiuni separate de ARN, iar masa de laborator trebuie curățată înainte de experiment, iar mănuși și măști de unică folosință trebuie purtate în timpul experimentului pentru a evita degradarea ARN cauzată de introducerea RNazei în cea mai mare măsură.

4.Reactivul este contaminat cu RNază în timpul utilizării.

   Sugestie: Înlocuiți cu o nouă serie de truse de extracție a ARN total din plante pentru experimente conexe.

5. Tuburile de centrifugă și vârfurile pipetei utilizate pentru manipularea ARN-ului sunt contaminate cu RNază.

Sugestie: Asigurați-vă că tuburile de centrifugă, vârfurile pipetei, pipetele etc. utilizate în extracția ARN sunt toate fără RNază.

Manuale de instructiuni:

Manual de instrucțiuni al trusei de izolare a ARN total al plantelor