RNază este un cuvânt sensibil pe care mulți studenți care desfășoară adesea experimente de extracție a ARN nu vor să-l audă.Complet înarmat, ARN-ul care a fost extras în cele din urmă cu reactivii foarte toxici fenol și cloroform a fost degradat.Nu sunt împăcat!!!Astăzi, să aruncăm o privire la originea faimosului Rnase.

Ribonucleaza (RNază) sau RNază este o nuclează care poate hidroliza ARN-ul în molecule mici.RNaza, ca proteină cu moleculă mică, este neobișnuit de stabilă .Sterilizarea convențională cu abur la temperatură ridicată și presiune înaltă și inhibitorii proteici nu o pot inactiva complet.Stabilitatea RNazei provine în principal din legăturile disulfurice din structură.De exemplu, RNaza utilizată în mod obișnuit a pancreasului bovin are doar 124 de aminoacizi, dar conține 4 legături disulfură.Legătura de sulf și legătura disulfură conferă RNaza o stabilitate termică excelentă.În plus, rnaza are o greutate moleculară relativ mică și își poate restabili rapid conformația inițială în multe cazuri.

Pe lângă faptul că este extrem de stabil,RNazele sunt omniprezente în laborator .RNaza este un mecanism biologic de apărare.Pentru o celulă, ARN-ul exogen este adesea fatal.În comparație cu ADN-ul exogen, ARN-ul exogen este adesea mai periculos.ARN-ul este transcris și tradus cu plăcere, astfel încât aproape toate organismele au dezvoltat RNaze pentru a se apăra împotriva invaziei ARN-ului exogen.Prin urmare, celulele bacteriene cultivate în laborator și tu care extragi ARN emană aroma RNazei.Fluidele corpului uman (salivă, lacrimi etc.) conțin o cantitate mare de RNază, așa că nu plângeți când ARN-ul este degradat.Cu cât plângi mai mult, cu atât degradarea ARN-ului este mai gravă!!Sora Daiyu nu este potrivită pentru extracția ARN!

În plus, pielea ta delicată conține și o mulțime de RNază, iar markerele, pipetele, ușile frigiderului și mânerele ușilor care au fost atinse de piele conțin și RNază.

Cu atâta divagație, să aruncăm o privire la cum să ne ocupăm de RNazele.

Primul lucru la care se gândește toată lumea atunci când elimină ARN-ul esteDEPC(pirocarbonat de dietil).DEPC denaturează în principal proteina prin combinarea cu inelul imidazol al grupului activ RNază histidină, inhibând astfel activitatea enzimei.0,1% DEPC poate avea un efect de îndepărtare mai bun asupra Rnazei, dar trebuie să fim atenți că DEPC este un cancerigen cunoscut, așa că trebuie acordată o atenție deosebită atunci când îl folosim.

Pentru RNază, trebuie să începem de la două aspecte,primul este de a inhiba activitatea RNazei endogene

Reactivii convenționali de extracție a ARN, cum ar fi izotiocianatul de guanidină și DTT, conținut în Trizol, pot deschide legătura disulfurică a RNazei, dar există încă unele RNaze, în special în probele de țesut, așa că acordați atenție temperaturii scăzute.

1.Scufundați imediat proba de țesut în azot lichid după ce o scoateți sau într-o soluție comercială de conservare a ARN.

2.După extragerea ARN-ului probei de celule, se adaugă la soluția de liză și se lizează pe cutia de gheață

3. Cel mai bine este să folosiți azot lichid pentru măcinare când probele de țesut sunt omogenizate.Când utilizați un omogenizator electric fără azot lichid, acordați atenție pre-răcirii complete a adaptorului de omogenat.

A doua este DNaza exogenă

1.Fiți înarmați complet, purtați o halat de laborator, purtați o mască și asigurați-vă că purtați o pereche de mănuși noi (nu fi atât de economisitor! Trebuie remarcat că Trizolul este super coroziv și este, de asemenea, foarte puternic prin mănuși, așa că nu picurați pe mâini).

2.Toate vârfurile pipetei utilizate, tuburile EP, tuburile PCR și alte echipamente trebuie tratate cu de-RNază.Poate fi înmuiat în DEPC 0,1% și apoi presurizat la presiune înaltă.Atenție la funcționarea într-o hotă.Tiranii locali pot cumpăra direct consumabile pentru îndepărtarea enzimelor.

PS: Să-ți spun o metodă leneșă.Deși temperatura ridicată și presiunea ridicată nu pot elimina complet RNaza, aceasta va elimina o mare parte a acesteia.De 2 ori de temperatură ridicată și presiune ridicată au un efect bun, iar extracția ARN are un efect redus.

3.Alcoolul poate denatura proteinele,astfel încât masa de extracție a ARN poate fi șters cu alcool 75%. , iar mănușile pot fi, de asemenea, pulverizate cu alcool.

4.Soluția finală de dizolvare a ARN-ului și tubul de centrifugare ar trebui, de asemenea, tratate cu de-RNază.Apa DEPC este o soluție de dizolvare a ARN utilizată în mod obișnuit.Să vorbim despre metoda corectă de preparare a apei DEPC (nu uitați să reambalați DEPC-ul comercial când îl cumpărați)

Adăugați DEPC în apă ultrapură la 1:1000, agitați bine, lăsați să stea peste noapte la 37°C și sterilizați la 121°C la temperatură ridicată și presiune ridicată timp de 15 minute.Apa DEPC poate fi păstrată la -20°C în alicote de 1 ml.

În sfârșit, pentru a rezuma: temperatura scăzută este cheia, consumabilele sunt bine manipulate, complet armate și mai puține discuții!

Ei bine, asta e tot pentru strategia de azi.Vă doresc toată concentrația și puritatea de ARN de care ați menționat.Ambele A260/A280 sunt 2.0!!!

Desigur, dacă utilizați unKit de extracție ARN de funcționare la temperatura camerei, este posibil să nu întâmpinați problemele de mai sus.

Funcționarea la temperatura camerei, fără adăugarea de DNază, extrage ARN total din celule în 11 minute și extrage ARN total din țesuturi animale sau plante în 30 de minute.

Pentru mostre de probă, vă rugăm să contactați:overseas@foregene.com

Produse asemanatoare:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/