RT-qPCR este experimentul de bază al biologiei moleculare și toată lumea trebuie să fie familiarizată cu el.Acesta include în principal trei etape: extracția ARN, transcrierea inversă în ADNc și PCR cantitativ fluorescent în timp real.Nu ajută, ce se întâmplă?Este probabil să existe o problemă cuexperimentul de transcriere inversă!Deși se pare că experimentul de transcripție inversă trebuie doar să adauge ARN, dNTP, primeri șirevers transcriptazăla tubul de centrifugă și amestecați bine, dar în procesul de funcționare propriu-zis, există încă multe detalii cărora trebuie să le acordați atenție.Să învățăm despre asta!

Cum să judeci calitatea ARN-ului?
Pentru a obține cADN, calitatea ARN-ului este critică!Calitatea ARN poate fi detectată în principal din două aspecte:
(1) Integritatea ARN:Integritatea ARN poate fi verificată prin electroforeză pe gel de agaroză. Luând eucariote ca exemplu, ARN-ul total complet are trei benzi clare, greutățile moleculare de la mare la mici sunt 28S, 18S și 5S, iar 28S este de două ori mai luminos decât 18S;dacă pot fi văzute trei benzi, dar tipul de bandă este neclar sau Difuzia înseamnă că ARN-ul este parțial degradat.În acest moment, vă rugăm să efectuați imediat reacția de transcriere inversă și să măriți în mod corespunzător introducerea șablonului;dacă doar o bandă cu o greutate moleculară mică sau nicio bandă poate fi văzută, ARN-ul a fost complet degradat și trebuie reextras.Agilent 2100 indică integritatea ARN-ului cu diagrama de vârf și valoarea RIN.Dacă acidul nucleic este intact, linia de bază a electroferogramei este plată;dacă acidul nucleic este sever degradat, linia de bază este neuniformă și apar mai multe vârfuri de degradare;valoarea RIN reflectă integritatea ARN-ului, în intervalul 0-10, cu cât valoarea este mai mare, cu atât este mai bună calitatea ARN-ului.Ei bine, cu cât este mai mare gradul de completitudine.
(2) Puritatea ARN:Raportul OD260/280 poate fi detectat prin spectrofotometrie UV.Dacă raportul OD260/280 este între 1,9 și 2,1, puritatea este foarte bună.
ADN-ul genomic rezidual poate duce la rezultate cantitative inexacte
Când ARN-ul este extras, ARN-ul pe care îl obținem poate fi amestecat cu ADN-ul genomic (gDNA) care nu a fost curățat.Prin urmare, cADN-ul după transcrierea inversă va fi, de asemenea, amestecat cugADN.În timpul avaluluiqPCRreacţie,cADNși gDNA poate fi amplificat simultan, rezultând o valoare CT relativ mică, astfel încât rezultatele pot fi părtinitoare.
Deci ce ar trebui să facem în această situație?Foregenesugereaza:
(1) Efectuați curățarea genomului pe ARN-ul inversat, care poate fi îndepărtat prin extracția coloanei în timpul extracției ARN;
(2) Tratați ARN-ul extras cu DNazăI , dar terminați-l cu EDTA;
de reactivi de transcriere inversăcu module de curățare a genomului;

Cum să alegi primeri pentru transcrierea inversă?
Primerii de transcripție inversă afectează, de asemenea, rezultatul reacției de transcripție inversă.Puteți alege primeri aleatoriu, Oligo dT sau primeri specifici genei pentru transcrierea inversă în funcție de circumstanțele specifice ale experimentului:
(1) Stenograme specifice: se recomanda primeri specifici genelor;
(2) Transcrieri de fragmente lungi: Se recomandă primeri Oligo dT/gene-specifici;
(3) Fragmente interne ale transcrierilor cu segment lung: primeri specifici genei/ primeri aleatoriu / primeri aleatoriu + Oligo dT.Dacă se efectuează experimentul qPCR ulterior, Oligo dT nu poate fi utilizat singur, deoarece utilizarea singură a Oligo dT poate cauza polarizarea finală 3′, ceea ce duce la rezultate inexacte ale experimentului qPCR;
(4) miARN: Se pot folosi grunduri stem-loop sau grunduri de coadă.

De câte ori ar trebui să fie diluat ADNc-ul produsului de transcripție inversă pentru cuantificare?
După obținerea ADNc-ului produsului de transcripție inversă, de câte ori trebuie diluat ADNc-ul pentru experimentele qPCR este foarte important.Dacă concentrația de ADNc este prea mare sau prea scăzută, eficiența de amplificare poate fi afectată.Se poate măsura concentrația de ADNc și cum ar trebui făcută?
(1) Concentrația de ADNc a produsului de transcripție inversă nu poate fi măsurată, deoarece, pe lângă produsul de ADNc, produsul de transcripție inversă conține și tampon rezidual de transcripție inversă, transcriptază inversă, primeri etc., care vor interfera cu rezultatele măsurării concentrației și vor cauza raportul OD260/280, OD260/230 și, prin urmare, nu reflectă cDNA anormal.În acest moment, unii prieteni vor spune, atunci voi măsura concentrația după purificare;aici, Foregene dorește să reamintească că ADNc-ul nu este recomandat să fie purificat, deoarece lungimea ADNc-ului obținut prin inversare este diferită, iar ADNc-ul scurt se va pierde în purificare.
(2) Deci ce să faci?Înainte de experimentul qPCR, gradientul de diluție al ADNc poate fi determinat prin pre-experiment.De exemplu: utilizați soluție stoc de ADNc, diluție de 10 ori și diluție de 100 de ori ca șabloane pentru experimentele qPCR și selectați factorul de diluție cu o valoare CT în intervalul 18-28.

Cum ar trebui miARN-urile să fie transcrise invers?
miARN este o moleculă mică de ARN monocatenar cu o dimensiune de aproximativ 22 nt care nu codifică proteine.Din cauza lungimii sale scurte, metoda qPCR convențională este dificil de cuantificat direct, deci este adesea necesară extinderea miARN-ului;metodele de transcripție inversă utilizate în mod obișnuit pentru miARN includ metoda stem-loop și metoda tailing.
Metoda stem-loop este de a extinde miARN prin adăugarea de primeri stem-loop.Această metodă de detectare are o sensibilitate și o specificitate mai ridicate, dar debitul de detectare este scăzut.O transcriere inversă poate detecta doar un miARN și o referință internă;metoda de adăugare a cozii este compusă din două Este completată de acțiunea comună a două enzime, care sunt polimeraza PolyA și transcriptaza inversă.Polimeraza PolyA este responsabilă pentru adăugarea cozilor PolyA la miARN pentru a-i crește lungimea, iar transcriptaza inversă realizează reacția de transcripție inversă.Această metodă are un randament mare de detecție și poate detecta mai multe miARN și referințe interne într-o transcriere inversă, dar sensibilitatea și specificitatea sunt scăzute în metoda stem-loop.