Toată lumea vorbește despre principiul experimentului qRT-PCR, proiectarea primerului, interpretarea rezultatelor etc., dar cred că ar trebui să vă împărtășesc operațiunea experimentală a qRT-PCR.Este mic, dar este vorba de rezultate.
Înainte de a face qRT-PCR, trebuie să avem o înțelegere clară a ARN-ului și a metodelor de operare.La urma urmei, eforturile noastre sunt menite să obțină rezultate, mai degrabă decât să exersăm.Deci, înainte de a face qRT-PCR, trebuie să determinăm următoarele probleme (dintre care unele sunt aplicabile numai pentru SYBR).
1 Ești sigur că ARN-ul tău nu este degradat?
NanoDrop 2000 poate detecta doar concentrația și puritatea ARN-ului, dar nu poate detecta integritatea ARN-ului.
Valoarea ARN (ARN Intesity Number) poate reflecta integritatea ARN, care este detectată de sistemul Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Diagrama schematică a valorilor RIN pentru diferite probe de ARN (eucariote)
Cu toate acestea, laboratoarele în general nu au Bioanalyzer Agilent 2100.În acest caz, putem detecta prin gel de formaldehidă, dar necesarul pentru cantitatea totală de ARN este mare, așa că cea mai rapidă metodă este utilizarea electroforezei obișnuite pe gel.Este necesar să fie într-un mediu fără nucleaze, deci este necesar să clătiți rezervorul de electroforeză, sticla de sol, suportul de gel și pieptănați cu apă DEPC.Agaroza este, de asemenea, fără nucleaze (atâta timp cât este proaspăt deschis), iar tamponul de încărcare ar trebui să fie proaspăt deschis cât mai mult posibil, cu 1,2% gel.
Rețineți că gelul trebuie să fie complet dizolvat, altfel va provoca benzi neomogene, așa cum se arată în proba 9 din figură.Dacă tensiunea este prea mare sau rulează prea mult timp va genera căldură și va provoca degradarea ARN-ului, astfel încât tensiunea și timpul ar trebui controlate în mod rezonabil.În plus, rularea gelului poate determina în continuare dacă există reziduuri de ADN în probă și poate observa dacă există un număr mare de benzi reținute în godeul de distribuire.
Figura.Detectarea ARN prin electroforeza pe gel
2 Ești sigur de concentrația ADNc-ului tău?
Experiența fraților mai mari din laborator este că ADNc-ul sistemului de 20 ul obținut prin fiecare inversare este diluat direct de 20X, în timp ce surorile post-doctorale sunt diluate de 10X.De obicei depind de situație.Deoarece calitatea ARN-ului menționat de fiecare persoană este diferită, nivelul de inversare este și el diferit, iar tehnologia de inversare poate să nu fie stabilă.
Deci, de fiecare dată când primesc ADNc inversat, îl voi dilua mai întâi de aproximativ 3 ori, apoi voi folosi gena de menaj pentru a face RT-PCR, numărul de cicluri este în general de 25 de cicluri, pentru a identifica concentrația specifică și apoi determina factorul de diluție final.
3 Ești sigur că grundurile tale sunt ușor de utilizat?
Poate trece de curba de topire a qRT-PCR, dar asta costă totuși bani.Pentru laboratoarele fără mulți bani, atunci când primesc mulți primeri, pot folosi RT-PCR obișnuit pentru a vedea dacă este o singură bandă și pentru a identifica specificitatea primerilor.Dacă laboratorul nu este lipsit de bani, specificul tuturor primerilor poate fi identificat o dată prin curba de topire.
4 Ești sigur că condițiile tale experimentale sunt potrivite?
SYBR ar trebui să fie protejat de lumină puternică, așa că încercați să stingeți lumina de deasupra când adăugați reactiv SYBR și trebuie să utilizați doar lumină slabă pentru a o finaliza.
Păstrați SYBR la 4°C.Când este utilizat, răsturnați ușor în sus și în jos pentru a se amesteca bine pentru a evita spuma și nu agitați puternic.
Unor surori mai mici le place să deseneze semne pe placa PCR de teamă să nu amestece mostrele, ceea ce este greșit.Deoarece markerii dvs. sunt foarte probabil să afecteze colecția de semnale fluorescente, recomand, în general, juniorilor să folosească notebook-uri experimentale pentru a ajuta la memorie, așa cum se arată mai jos.
Figura.Diagrama de încărcare a probei qRT-PCR
5 Ești sigur că faci bine?
Asigurați-vă că purtați mănuși, purtați mănuși, purtați mănuși și spuneți lucruri importante de trei ori.
Pentru a reduce expunerea SYBR la lumină, personal îmi place să adaug mai întâi un șablon, așa cum se arată în figura de mai jos.Conform experienței, adăugarea unei cantități mici de șablon poate cauza erori de eșantionare.Prin urmare, pentru a minimiza eroarea cauzată de adăugarea unei cantități mici de șablon, de obicei dublez din nou proba și dubl cantitatea atunci când adaug proba pentru a reduce cantitatea de H2O2 adăugată.
Figura.Diagrama schematică a încărcării qRT-PCR
Apoi configurați sistemul qRT-PCR după cum urmează.
Figura.Diagrama de pregătire a sistemului qRT-PCR
NOTĂ: Procesul de configurare trebuie efectuat pe gheață.
După adăugarea probei, lipiți filmul transparent de etanșare.Încercați să nu atingeți suprafața foliei transparente de etanșare cu mâinile, operați doar din spațiul de pe ambele părți ale foliei.Deoarece amprentele pot afecta și colectarea semnalelor fluorescente.Apoi utilizați o centrifugă pentru a centrifuga rapid timp de 10 s la viteză mică pentru a preveni agățarea probei de perete.
Produse asemanatoare:
Ora postării: 28-apr-2023
