Experimentul RT-qPCR include extracția ARN și evaluarea calității, transcripția inversă și qPCR trei pași, fiecare pas are o mulțime de precauții, vom introduce în detaliu mai jos.

Ⅰ.Evaluarea calității ARN

În experimentul RT-qPCR, după finalizarea extracției ARN, calitatea ARN trebuie evaluată, iar experimentul de urmărire poate fi efectuat numai după ce este calificat.Metodele de evaluare includ spectrofotometrul, electroforeza pe gel Agilent, analiza Agilent 2100, printre care spectrofotometrul cel mai frecvent utilizat și metoda de detectare a electroforezei pe gel de agaroză.Trebuie remarcat faptul că aceste două metode trebuie utilizate împreună pentru a finaliza detectarea și analiza concentrației, purității și integrității ARN, astfel încât să se asigure calitatea ARN.

Kit de izolare ARN asociat: 

Kit de izolare a ARN total al celulelor

ARN total foarte purificat și de înaltă calitate poate fi obținut din diferite celule cultivate în 11 minute.

Kit de izolare a ARN total animal

Extrageți rapid și eficient ARN total de înaltă puritate și de înaltă calitate din diferite țesuturi animale.

Spectrofotometru:

Spectrofotometrul este utilizat în principal pentru a determina concentrația și puritatea ARN-ului, dar nu poate detecta integritatea ARN-ului și a reziduului genomic.Printre aceștia, A260/280 și A260/230 sunt parametri importanți pentru detectarea purității ARN, iar puritatea ARN poate fi detectată în funcție de fluctuația valorilor lor:

1. 1,9< A260/280< 2,1, indicând că puritatea ARN este bună;A260/280<1,9, indicând că poate exista un reziduu proteic în ARN;A260/280>2.1, indicând o posibilă degradare parțială a ARN, care poate fi confirmată în continuare prin electroforeză pe gel de agaroză.

2. 2.0< A260/230< 2.2, indicând că puritatea ARN este bună;A260/230< 2,0, indicând că pot exista reziduuri de reactivi organici în ARN, cum ar fi fenoli, etanol sau zaharuri.

Electroforeza pe gel de agaroză:

Testul de electroforeză pe gel de agaroză poate analiza integritatea ARN, genomul și reziduurile de proteine, dar nu poate cuantifica cu exactitate concentrația de ARN sau detecta reziduurile de reactivi organici.Luați șabloanele ARN eucariote, de exemplu:

1. ARN-ul a fost supus electroforezei pe gel de agaroză.Dacă pe harta gelului au existat doar trei benzi unice de 28sRNA, 18sRNA și 5.8sRNA, aceasta indică faptul că ARN-ul extras este intact.Dacă există un fenomen de tragere, acesta indică degradarea parțială a ARN.

2. Dacă există o singură bandă strălucitoare între gaura de lipici și banda 28sRNA, este posibil să existe reziduuri de ADN genomic.

3. Dacă apar benzi în gaura de lipici, aceasta indică faptul că pot exista reziduuri de proteine ​​și alte substanțe macromoleculare.

Ⅱ. Transcriere inversă

După ce extracția ARN-ului este finalizată, acesta trebuie să fie inversat în cADN pentru experimentele ulterioare, astfel încât etapa de inversare este esențială.Transcripția inversă va fi introdusă din selecția transcriptazei inverse și a primerului:

Selecția inversă a transcriptazei:

Reverse transcriptazele tipice includ AMV RTaza și MMLV RTaza.RNaza H a AMV RTază are activitate puternică, lungime scurtă de sinteză, cantitate redusă de sinteză și stabilitate termică bună (42 ~ 55 ℃).Activitatea RNazei H a MMLV RTază este slabă, lungimea sintezei este lungă, cantitatea de sinteză este mare și stabilitatea termică este slabă (37 ~ 42 ℃).

Deoarece enzima RNază H are funcția de degradare a matriței ARN, MMLV cu activitate slabă a RNazei H ar trebui selectat de preferință în timpul transcripției inverse, iar după inginerie genetică ulterioară, stabilitatea termică a MMLV a atins un salt calitativ.Luând ForegeneTranscriptază inversă Foreasy (M-MLV pentru transcripție inversă) de exemplu, este o nouă transcriptază inversă exprimată în bacterii modificate prin inginerie E. coli folosind tehnologia de recombinare genetică.Este o ADN polimerază recombinantă care sintetizează o catenă complementară de ADN din ARN monocatenar, ADN sau un hibrid ARN:ADN.Nu are activitate RNază H, stabilitate puternică, afinitate puternică pentru ARN și sensibilitate ridicată la detecție.

 

Transcriptază inversă Foreasy (M-MLV pentru transcripție inversă)

Alegerea grundului:

În general, primerii RT se împart în trei categorii: oligo dT, primeri aleatori și primeri specifici genei.Selectați grunduri adecvați pentru utilizare conform diferitelor cerințe experimentale.

1. Dacă șablonul este de origine eucariotă și ADNc târziu este utilizat pentru amplificarea PCR de rutină, se recomandă Oligo (dT);Dacă experimentul următor este utilizat numai pentru qPCR, se recomandă amestecarea Oligo (dT) cu primeri aleatori pentru a îmbunătăți eficiența transcripției inverse.

2. Dacă șablonul este de la procariote, primeri aleatori sau primeri specifici genei trebuie selectați pentru transcrierea inversă.

Ⅲ.qPCR

Cuantificarea fluorescenței este elaborată în principal din selecția metodelor cantitative, principiile de proiectare a primerului, selecția ROX, configurația sistemului de reacție și setarea condițiilor de reacție etc.

Selectarea metodelor cantitative:

Metodele cantitative sunt împărțite în metode cantitative relative și metode cantitative absolute.Cuantificarea relativă poate fi utilizată pentru a detecta efectul anumitor metode de tratament asupra expresiei genelor, a detecta diferența de expresie a genelor în momente diferite și a compara diferența de expresie a genelor în diferite țesuturi.Cuantificarea absolută poate detecta cantitatea de acid nucleic din virus și așa mai departe.Când facem experimente, trebuie să alegem metodele cantitative adecvate conform propriilor experimente.

Principii de proiectare a amorsei:

Proiectarea primerului pentru qPCR este direct legată de eficiența amplificării și specificitatea produsului.Prin urmare, proiectarea corectă a primerilor buni este primul pas al qPCR de succes.La proiectarea grundului, ar trebui să se acorde atenție următoarelor principii atunci când se respectă principiul designului grundului convențional:

1. Lungimea fragmentului țintă este controlată între 100 și 300 bp;

2. Design cross-exon pentru a evita influența ADN-ului genomic;

3. Primerii proiectați trebuie testați pentru eficiența de amplificare și numai atunci când eficiența de amplificare atinge standardul (90-110%) pot fi utilizați pentru experimente cantitative;

4. Concentrația primerului este de obicei optimizată între 0,1 uM și 1,0 uM.

Selectie deROX:

În procesul de reacție cantitativă, ROX poate ajusta uniform diferența de cale optică, eroarea de pipetare sau diferența de volum cauzată de evaporare și condensare, îmbunătățind repetabilitatea rezultatelor.Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că selecția ROX este legată de instrument.Dacă instrumentul qPCR are funcția de a corecta automat diferența dintre găuri, nu trebuie să adauge ROX;în caz contrar, trebuie să adauge corecție ROX.Micii parteneri în achiziționarea de reactivi trebuie să fie conform instrumentului utilizat pentru a alege ROX-ul corect, pentru a evita greșelile ulterioare.

Pregătirea sistemului de reacție:

Sunt preferate volume de reacţie de 20ul şi 50ul.Următoarele aspecte ar trebui acordate atenție atunci când este formulat sistemul:

1. Sistemul de reacție trebuie pregătit prin ventilație în bancul de lucru ultra-curat, nou ddH₂O este folosit pentru fiecare experiment;

2. Fiecare experiment trebuie să pregătească NTC pentru a verifica dacă există poluare în sistem și fiecare pereche de amorse trebuie să facă NTC atunci când pregătește sistemul;

3. Pentru a detecta dacă există reziduuri de ADNg în matrița de ARN, NRT poate fi pregătit pentru fiecare probă pentru detectare;

4. La pregătirea sistemului, se recomandă să faceți cel puțin 3 repetări tehnice pentru o probă;

5. Când șablonul este ADNc, se recomandă diluarea de 5-10 ori pentru a reduce efectul de inhibare al sistemului de transcripție inversă pe experimentul qPCR.Este mai bine să explorați cantitatea de șablon după gradient, astfel încât valoarea CT să se încadreze între 20-30;

6. Determinați numărul necesar de reacții, creșteți cu 5-10% pe baza numărului de reacții și calculați numărul de configurare a volumului;

7, sistemul este pregătit utilizând principiul premixului, amestecând după centrifugare și să nu se asigure bule;

8, Pe cât posibil să alegeți consumabilele de sprijin.

Kit RT-qPCR asociat