Sterilizarea vârfurilor de pipetă și a tuburilor EP etc.
1. Se prepară 0,1% (o miime) DEPC (substanță foarte toxică) cu apă deionizată, se folosește cu grijă într-o hotă și se păstrează la 4°C ferit de lumină;
Apa DEPC este apă pură tratată cu DEPC și sterilizată la temperatură ridicată și presiune înaltă.Testat pentru a nu conține RNază, DNază și proteinază.
2. Puneți vârful pipetei și tubul EP în DEPC 0,1% și asigurați-vă că vârful pipetei și tubul EP sunt umplute cu DEP 0,1%.
3. Protejați de lumină, lăsați să stea, peste noapte (12-24h)
4. Cutia care conține vârful și tubul EP nu trebuie să fie înmuiată în DEPC.După ce ați îndepărtat aproximativ apa DEPC din vârful sau tubul EP, împachetați-o și înfășurați-o.
5. 121 grade Celsius, 30min
6. 180 grade Celsius, uscat câteva ore (cel puțin 3 ore)
Notă: a.Purtați mănuși și măști din latex când manipulați DEPC!b, sau fără sterilizare DEPC, 130 ℃, autoclavă 90 min (multe laboratoare sterilizare la temperatură înaltă de două ori)
Considerații privind extracția ARN
Două fenomene majore de eșec de izolare a ARN-ului tisular
degradarea ARN și reziduurile de impurități în țesuturi,în ceea ce privește degradarea, să vedem mai întâi de ce ARN-ul extras din celulele cultivate nu este ușor de degradat.Reactivii de extracție a ARN existenți conțin toți componente care inhibă rapid RNaza.Adăugați lizat la celulele de cultură și amestecați-l pur și simplu, toate celulele pot fi bine amestecate cu lizat și celulele sunt complet lizate.După ce celulele sunt lizate, ingredientele active din lizat inhibă imediat RNaza intracelulară, astfel încât ARN-ul rămâne intact.Adică, deoarece celulele cultivate sunt ușor și complet contactate cu lizat, ARN-ul lor nu este ușor degradat;pe de altă parte, ARN-ul din țesut este ușor degradat, deoarece celulele din țesut nu sunt ușor de contactat rapid cu lizat.datorită contactului suficient.Asa de,presupunând că există o modalitate de a transforma țesutul într-o singură celulă în timp ce se inhibă activitatea ARN, problema degradării ar putea fi complet rezolvată.
Măcinarea cu azot lichid este cea mai eficientă astfel de metodă.Cu toate acestea, metoda de măcinare cu azot lichid este foarte supărătoare, mai ales când numărul de probe este mare.Acest lucru a dat naștere celui mai bun lucru: omogenizatorul.Theomogenizatormetoda nu ia în considerare problema modului în care activitatea RNazei este inhibată înainte ca celulele să fie contactate cu lizat, ci mai degrabă se roagă ca rata de distrugere a țesutului să fie mai rapidă decât rata la care RNaza intracelulară degradează RN.
Efectul omogenizatorului electric este mai bun,iar efectul omogenizatorului de sticlă este slab, dar, în general, metoda omogenizatorului nu poate preveni fenomenul de degradare.Prin urmare, dacă extracția este degradată, omogenizatorul electric original trebuie utilizat pentru măcinarea cu azot lichid;omogenizatorul de sticlă original trebuie schimbat cu un omogenizator electric sau măcinat direct cu azot lichid.Problema este aproape 100% fezabilă.rezolvați.
Problema reziduurilor de impurități care afectează experimentele ulterioare are cauze mai diverse decât degradarea, iar soluțiile sunt în mod corespunzător diferite.În concluzie,dacă există degradare sau impurități reziduale în țesut, trebuie optimizată metoda de extracție/reactiv pentru materialul experimental specific.Nu trebuie să vă folosiți mostrele prețioase pentru optimizare: puteți cumpăra niște animale mici precum pește/pui de pe piață, puteți lua partea corespunzătoare din material pentru extracția ARN, iar cealaltă parte pentru extracția proteinelor – măcinați cu gura, stomac și intestine Extract.
ARN-ul țintă al ARN-ului extras este utilizat pentru diferite experimente ulterioare, iar cerințele sale de calitate sunt diferite
Construcția bibliotecii de ADNc necesită integritate ARN fără reziduuri de inhibitori ai reacției enzimatice;Northern necesită o integritate mai mare a ARN și cerințe mai mici pentru reziduurile de inhibitori ai reacției enzimatice;RT-PCR nu necesită o integritate prea mare a ARN,dar inhibă reacţiile enzimatice.Cerințele privind reziduurile sunt stricte.Intrarea determină ieșirea;de fiecare dată când scopul este de a obține ARN de cea mai înaltă puritate, va costa oamenii și banii.
Colectarea/Depozitarea Probelor
Factori care afectează degradarea După ce proba părăsește corpul viu/sau mediul inițial de creștere, enzimele endogene din probă vor începe să degradeze ARN-ul,iar viteza de degradare este legată de conținutul de enzime endogene și de temperatură.În mod tradițional, există doar două moduri de a inhiba complet activitatea enzimatică endogene: adăugați imediat lizat și omogenizați complet și rapid;tăiați în bucăți mici și congelați imediat în azot lichid.Ambele abordări necesită operare rapidă.Acesta din urmă este potrivit pentru toate probele, în timp ce primul este potrivit doar pentru țesuturi cu conținut scăzut de celule și enzime endogene și mai ușor de omogenizat.Mai exact, țesutul vegetal, ficatul, timusul, pancreasul, splina, creierul, grăsimea, țesutul muscular etc. sunt cel mai bine înghețați cu azot lichid înainte de a continua.
Fragmentarea și omogenizarea probelor
Factori care afectează degradarea și randamentul Fragmentarea probei estepentru omogenizare temeinică, care este pentru eliberarea completă și completă a ARN.Celulele pot fi omogenizate direct fără a fi sparte.Țesuturile pot fi omogenizate numai după ce au fost sparte.Drojdia și bacteriile trebuie sparte cu enzimele corespunzătoare înainte de a putea fi omogenizate.Țesuturile cu conținut mai mic de enzime endogene și omogenizare mai ușoară pot fi zdrobite și omogenizate la un moment dat în lizat de un omogenizator;țesut vegetal, ficat, timus, pancreas, splină, creier, grăsime, țesut muscular și alte probe, fie sunt bogate în enzime endogene, fie nu sunt ușor de omogenizat,deci ruperea țesuturilor și omogenizarea trebuie efectuate separat.Cea mai fiabilă și mai productivă metodă de fragmentare este măcinarea cu azot lichid, iar cea mai fiabilă metodă de omogenizare este utilizarea unui omogenizator electric.O notă specială despre măcinarea cu azot lichid: proba nu trebuie dezghețată pe parcursul întregului proces de măcinare, deoarece enzimele endogene sunt mai probabil să funcționeze atunci când sunt congelate.
Alegerea lizatului
Afectarea confortului de funcționare și a factorilor impurităților endogene reziduale Soluțiile de liză utilizate în mod obișnuit pot aproape inhiba activitatea RNazei.Prin urmare, punctul cheie al alegerii unei soluții de liză este de a lua în considerare în combinație cu metoda de purificare.Există o excepție:eșantioanele cu conținut ridicat de enzime endogene se recomandă utilizarea unui lizat care conține fenol pentru a crește capacitatea de a inactiva enzimele endogene.
Alegerea metodei de purificare
Factori care afectează impuritățile endogene reziduale, viteza de extracție Pentru probele curate, cum ar fi celulele, se pot obține rezultate satisfăcătoare cu aproape orice metodă de purificare la îndemână.Dar pentru multe alte probe, în special pentru cele cu niveluri ridicate de impurități, cum ar fi plante, ficat, bacterii etc., alegerea unei metode de purificare adecvată este crucială.Metoda de purificare centrifugală pe coloană are o viteză de extracție rapidă și poate elimina eficient impuritățile care afectează reacția enzimatică ulterioară a ARN-ului, dar este costisitoare (Foregene poate oferi kituri rentabile, mai multe detalii faceți clic peAici);folosind metode de purificare economice și clasice, precum precipitarea LiCl, se poate obține și rezultate satisfăcătoare, dar timpul de funcționare este lung..
„Trei discipline și opt atenții” pentru extracția ARN
Disciplina 1:Pune capăt contaminării enzimelor exogene.
Nota 1:Purtați cu strictețe măști și mănuși.
Nota 2:Tuburile de centrifugare, capetele vârfurilor, tijele de pipetă, rezervoarele de electroforeză și băncile experimentale implicate în experiment trebuie eliminate complet.
Nota 3:Reactivii/soluțiile implicate în experiment, în special apa, trebuie să fie lipsite de RNază.
Disciplina 2:Blocați activitatea enzimelor endogene
Nota 4:Alegeți o metodă de omogenizare adecvată.
Nota 5:Alegeți un lizat adecvat.
Nota 6:Controlați cantitatea de pornire a probei.
Disciplina 3:Clarificați scopul de extracție
Nota 7:Cu orice sistem de lizat care se apropie de cantitatea de pornire maximă de probă, rata de succes a extracției scade brusc.
Nota 8:Singurul criteriu economic pentru extracția cu succes a ARN-ului este succesul în experimentele ulterioare, nu randamentul.
Top 10 surse de contaminare cu RNază
1. Degetele sunt prima sursă de enzime exogene, așa că mănușile trebuie purtate și înlocuite frecvent.În plus, trebuie purtate și măști, deoarece respirația este și o sursă importantă de enzime.Un avantaj suplimentar al purtării unei măști de mănuși este protejarea experimentatorului.
2. Vârfuri de pipetă, tuburi de centrifugă, pipete – RNaza nu poate fi inactivată numai prin sterilizare, astfel încât vârfurile de pipetă și tuburile de centrifugă trebuie tratate cu DEPC, chiar dacă sunt marcate ca tratate cu DEPC.Cel mai bine este să folosiți o pipetă specială, să o ștergeți cu o minge de vată cu alcool 75% înainte de utilizare, în special tija;în plus, asigurați-vă că nu utilizați un dispozitiv de îndepărtare a capului.
3. Apa/tamponul trebuie să fie lipsit de contaminare cu RNază.
4. Cel puțin masa de testare trebuie curățată cu bile de bumbac cu alcool 75%.
5.ARNază endogene Toate țesuturile conțin enzime endogene, așa că înghețarea rapidă a țesuturilor cu azot lichid este cea mai bună modalitate de a reduce degradarea.Metoda de stocare/măcinare a azotului lichid este într-adevăr incomod, dar este singura modalitate pentru țesuturile cu niveluri ridicate de enzime endogene.
6. Probe de ARN Produsele de extracție de ARN pot conține urme de contaminare cu RNază.
7. Extracția cu plasmide Extracția cu plasmide folosește adesea Rnaza pentru a degrada ARN-ul, iar Rnaza reziduală trebuie digerată cu Proteinaza K și extrasă prin PCI.
8. Depozitarea ARN Chiar dacă este depozitat la temperatură scăzută, urme de RNază vor provoca degradarea ARN.Cea mai bună soluție pentru conservarea pe termen lung a ARN-ului este o suspensie sare/alcool, deoarece alcoolul inhibă toată activitatea enzimatică la temperaturi scăzute.
9. Când cationii (Ca, Mg) conțin acești ioni, încălzirea la 80C timp de 5 minute va determina scindarea ARN-ului, așa că dacă ARN-ul trebuie încălzit, soluția de conservare trebuie să conțină un agent de chelare (1 mM Citrat de sodiu, pH 6,4).
10. Enzimele utilizate în experimentele ulterioare pot fi contaminate cu RNază.
10 sfaturi pentru extracția ARN
1: Preveniți rapid activitatea RNazelor.Probele sunt înghețate rapid după colectare, iar RNaza este inactivată prin operare rapidă în timpul lizei.
2: Alegeți o metodă de extracție adecvată pentru țesutul cu conținut ridicat de ribozime, iar țesutul adipos este cel mai bine să utilizați metoda care conține fenol.
3: Calitatea predicției necesită Northern, construcția bibliotecii de ADNc necesită integritate ridicată, iar RT-PCR și RPA (testul de protecție a ribonucleazei) nu necesită integritate ridicată.RT-PCR necesită puritate ridicată (reziduuri de inhibitori de enzime).
4: Omogenizarea temeinică este cheia îmbunătățirii randamentului și reducerii degradării.
5: Verificați integritatea detectării electroforezei ARN, 28S: 18S = 2:1 este un semn complet, 1:1 este, de asemenea, acceptabil pentru majoritatea experimentelor.
6: Îndepărtarea ADN-ului pentru RT-PCR, analiza matricei Cel mai bine este să utilizați Dnaza I pentru a îndepărta ADN-ul.
7: Reduceți contaminarea cu enzime exogene – enzimele nu pot fi importate din exterior.
8: Când se concentrează acid nucleic cu concentrație scăzută, trebuie adăugat un reactiv de co-precipitare.Dar pentru a preveni co-precipitantul care conține enzime și contaminarea ADN-ului.
9: Se dizolvă bine ARN-ul, dacă este necesar, se încălzește la 65°C timp de 5 minute.
metoda de depozitare adecvata
Poate fi păstrat la –20C pentru o perioadă scurtă de timp și la –80C pentru o perioadă lungă de timp.Primul pas în îmbunătățirea randamentelor de ARN este de a realiza că conținutul de ARN al diferitelor probe variază foarte mult.Abundență mare (2-4 ug/mg) cum ar fi ficat, pancreas, inimă, abundență medie (0,05-2 ug/mg) cum ar fi creier, embrion, rinichi, plămân, timus, ovar, abundență scăzută (<0,05 ug/mg) mg) cum ar fi vezica urinară, oase, grăsime.
1: Lizați celulele pentru a elibera RN - dacă ARN-ul nu este eliberat, randamentul va fi redus.Omogenizarea electrică funcționează mai bine decât alte metode de omogenizare, dar poate fi necesar să fie combinată și cu alte metode, cum ar fi piureul cu azot lichid, digestia enzimatică (Lizozimă/Liticaza)
2: Optimizarea metodei de extracție.Cele mai mari probleme cu metodele pe bază de fenol sunt stratificarea incompletă și pierderea parțială de ARN (supernatantul nu poate fi îndepărtat complet).Stratificarea incompletă se datorează conținutului ridicat de acid nucleic și proteine, care poate fi rezolvat prin creșterea cantității de lizat utilizat sau reducerea cantității de probă.O etapă de extracție cu cloroform a fost adăugată la țesutul adipos.Pierderea de ARN poate fi redusă prin pompare inversă sau prin îndepărtarea stratului organic urmată de centrifugare.Cea mai mare problemă cu metodele bazate pe centrifugare pe coloană este excesul de probă.
Sfaturi clasice de extracție
1. Purificarea cu fenol: Se adaugă un volum egal de 1:1 Fenol/Cloroform și se amestecă energic timp de 1-2 minute.Se centrifugă la viteză mare timp de 2 minute.Îndepărtați cu grijă supernatantul (80-90%).Nu ajunge niciodată la stratul mijlociu.Un volum egal de soluție de reacție poate fi adăugat la Fenol/Cloroform și supernatantul îndepărtat.Cei doi supernatanți pot fi amestecați împreună pentru precipitarea acidului nucleic pentru a îmbunătăți randamentul.Nu fiți prea blând când amestecați și nu încercați să îndepărtați tot supernatantul.
2. Spălare cu etanol 70-80%: În timpul spălării, acidul nucleic trebuie suspendat pentru a se asigura că sarea reziduală este spălată.În același timp, imediat după turnarea etanolului, se centrifugă la viteză mare timp de câteva secunde, apoi se îndepărtează etanolul rezidual cu o pipetă.Se dizolvă după ce a stat la temperatura camerei timp de 5-10 minute.
11. Extragerea organizaţiilor speciale
1. Țesutul fibros: Cheia extracției ARN din țesutul fibros, cum ar fi inima/mușchiul scheletic este de a perturba complet țesutul.Aceste țesuturi au o densitate celulară scăzută, astfel încât cantitatea de ARN pe unitate de greutate de țesut este scăzută și cel mai bine este să folosiți cât mai multă cantitate inițială posibil.Asigurați-vă că ați măcinat bine țesutul în condiții de îngheț.
2. Țesuturi cu conținut ridicat de proteine/grăsimi: conținutul de grăsimi din creier/vegetale este ridicat.După extracția PCI, supernatantul conține flocule albe.Supernatantul trebuie reextras cu cloroform.
3. Țesuturi cu conținut ridicat de acid nucleic/ribozimă: splina/timus are un conținut ridicat de acid nucleic și ribozimă.Măcinarea țesutului în condiții de îngheț, urmată de omogenizare rapidă poate inactiva eficient ribozimele.Totuși, dacă lizatul este prea vâscos (din cauza conținutului ridicat de acid nucleic), extracția PCI nu se va putea stratifica eficient;adăugarea mai multor lizat poate rezolva această problemă.Extracțiile multiple PCI pot elimina mai mult ADN rezidual.Dacă se formează un precipitat alb imediat după adăugarea alcoolului, acesta indică contaminarea ADN-ului.Re-extracția cu PCI acid după dizolvare poate elimina contaminarea ADN-ului.
4. Țesutul vegetal: țesutul vegetal este mai complex decât țesutul animal.În general, plantele sunt măcinate în condiții de azot lichid, astfel încât degradarea ARN de către enzimele endogene este neobișnuită.Dacă problema de degradare nu este rezolvată, este aproape sigur cauzată de impuritățile conținute în probă.Impuritățile conținute de multe plante vor duce la reziduuri, iar motivul reziduurilor este adesea pentru că aceste impurități au unele asemănări cu ARN: tu precipiti și eu precipit, iar tu adsorb și eu adsorb.Aceste caracteristici determină că sunt inhibitori de enzime foarte puternici.
În prezent, reactivii comerciali de extracție ARN pot fi adaptați la aproape toate țesuturile animale cu mici ajustări, dar există puțini reactivi comerciali de extracție ARN care pot fi adecvați pentru majoritatea țesuturilor vegetale.Din fericire, Foregene poate oferi specialtruse de extracție a ARN din plante, avemKit de izolare a ARN total al plantelor, Kit de izolare a ARN total al plantelor Plus.Acesta din urmă este special conceput pentru plantele cu conținut ridicat de polizaharide și polifenoli.Pentru extracția ARN, feedback-ul de la utilizatorii de laborator este deosebit de bun.
12. Efectul înghețului și decongelarii probei Proba congelată poate fi mai mare și trebuie tăiată înainte de a fi utilizată pentru extracția ARN.Probele tind să se topească (posibil parțial) în timpul tăierii.Este posibil ca probele congelate să fie nevoie să fie cântărite înainte de extracția ARN-ului, iar dezghețarea va avea loc cu siguranță în timpul acestui proces.Uneori, dezghețarea probei are loc și în timpul procesului de măcinare cu azot lichid;sau proba congelată este adăugată direct la lizat fără măcinarea azotului lichid, iar dezghețarea va avea loc cu siguranță înainte de omogenizarea completă.Experimentele au arătat că țesutul înghețat este mai predispus la degradarea ARN-ului în timpul decongelarii decât țesutul proaspăt.Motivul probabil: procesul de îngheț-dezgheț perturbă structurile din interiorul celulei, făcând mai ușor ca enzimele endogene să intre în contact direct cu ARN-ul.
13. Judecarea calității ARN De obicei, electroforeza este folosită pentru a judeca integritatea ARN, iar A260/A280 este folosit pentru a judeca puritatea ARN.În teorie, ARN-ul intact are un raport de 28S:18S = 2,7:1, iar majoritatea datelor subliniază raportul de 28S:18S = 2:1.Faptul este că aproape niciunul dintre ARN-ul extras din probe, în afară de celule, nu este într-un raport de 2:1 (acest lucru a fost obținut folosind Bioanalyzerul Agilent).
Rezultatele electroforezei ARN sunt afectate de mulți factori, inclusiv structura secundară, condițiile de electroforeză, încărcarea probei, gradul de saturație cu EB, etc. Utilizați electroforeza nativă pentru a detecta ARN și utilizați ADN Marker ca control.Dacă 28S la 2 kb și 18S la 0,9 kb sunt clare și 28S: 18S > 1, integritatea poate îndeplini cerințele majorității experimentelor ulterioare.
A260/A280 este un indicator care a provocat multă confuzie.În primul rând, este necesar să clarificăm semnificația inițială a acestui indicator pentru acizii nucleici: ARN pur, A260/280 său = aproximativ 2,0.ARN-ul pur este „cauza”, iar A260/A280 = 2 este „efectul”.Acum toată lumea folosește A260/A280 ca „cauză”, gândindu-se că „dacă A260/A280 = 2, atunci ARN-ul este pur”, ceea ce duce în mod natural la confuzie.
Dacă sunteți interesat, puteți adăuga puțin reactiv care este adesea folosit în extracție, cum ar fi fenol, izotiocianat de guanidină, PEG etc., la proba dvs. de ARN și apoi măsurați raportul A260/A280.Realitatea este că mulți dintre reactivii utilizați pentru extracția ARN, precum și multe impurități din probă, absorb aproximativ A260 și A280, afectând A260/A280.
Cea mai instructivă abordare în prezent este scanarea probelor de ARN în intervalul 200-300 nm.Curba ARN-ului pur are următoarele caracteristici: curba este netedă, A230 și A260 sunt două puncte de inflexiune, A300 este aproape de 0, A260/A280 = aproximativ 2,0 și A260/A230 = aproximativ 2,0.Dacă datele de scanare nu sunt disponibile, trebuie determinat și raportul A260/A230, deoarece acest raport este mai sensibil la transferul tuturor impurităților care afectează reacția enzimatică.Luați în considerare intervalul liniar al dispozitivului (0,1–0,5 pentru A260).
Mai sunt două fenomene utile: raportul va fi cu aproximativ 0,3 mai mic atunci când A260/A280 este măsurat în apă;în timp ce raportul măsurat în 10 mM EDTA este cu aproximativ 0,2 mai mare decât cel măsurat în 1 mM EDTA.
Produse asemanatoare:
China Plant Total ARN izolare Kit Producător și Furnizor |Foregene (foreivd.com)
Seria de izolare ARN – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Ora postării: Iul-15-2022
