Este bine cunoscut faptul că în dogma centrală, ARN-ul este mediatorul transcripțional între expresia ADN și proteine.În comparație cu detectarea ADN-ului, detectarea ARN-ului poate reflecta mai obiectiv expresia genelor în organisme.Experimentele care implică ARN includ: qRT-PCR, ARN-Seq și detectarea genelor de fuziune, etc. Pe baza caracteristicilor ARN-ului însuși (inelul de zahăr al ARN-ului are o grupare hidroxil liberă mai mult decât inelul de zahăr al ADN-ului), cuplat cu un număr mare de RNaze în mediu, ARN-ul este mai instabil și mai ușor de degradat decât ADN-ul.Garbage in, garbage out, dacă calitatea ARN-ului nu este bună, atunci rezultatele experimentale trebuie să fie nesatisfăcătoare, manifestate în mod specific ca date inexacte sau repetabilitate slabă.Prin urmare, ar trebui acordată mai multă atenție procesării ARN-ului, iar legătura de control al calității este, de asemenea, mai importantă pentru a asigura precizia și acuratețea datelor experimentale ulterioare.

Pentru controlul calității ARN, există, în general, următoarele metode frecvent utilizate:

• Spectrofotometrie
• electroforeza pe gel de agaroză
• Bioanalizator Agilent
• PCR cantitativ fluorescent în timp real
• Metoda vopselei fluorescente Qubit

01 Spectrofotometrie

ARN-ul are legături duble conjugate și are un vârf de absorbție la o lungime de undă de 260 nm.Conform legii lui Lambert-Beer, putem calcula concentrația de ARN din vârful de absorbție la 260 nm.În plus, putem calcula și puritatea ARN-ului în funcție de raportul dintre vârfurile de absorbție de 260 nm, 280 nm și 230 nm.280nm și 230nm sunt vârfurile de absorbție ale proteinelor și, respectiv, ale moleculelor mici.Raportul dintre A260/A280 și A260/A230 de puritate ARN calificată ar trebui să fie mai mare de 2. Dacă este mai mic de 2, înseamnă că există o contaminare cu proteine ​​sau molecule mici în proba de ARN și trebuie purificată din nou.Sursele de contaminare vor afecta experimentele din aval, cum ar fi inhibarea eficienței de amplificare a reacțiilor PCR, rezultând rezultate cantitative inexacte.Puritatea ARN-ului are o mare influență asupra rezultatelor ulterioare, astfel încât spectrofotometria este în general o legătură indispensabilă de control al calității în primul pas în experimentele cu acid nucleic.

Figura 1. Spectrul de absorbție tipic ARN/ADN

02 Electroforeză pe gel de agaroză

Pe lângă puritate, integritatea ARN este, de asemenea, unul dintre indicatorii importanți pentru evaluarea calității ARN.Degradarea ARN-ului va duce la un număr mare de fragmente scurte în probă, astfel încât numărul de fragmente de ARN care pot fi detectate efectiv și acoperite de secvența de referință va fi redus.Integritatea ARN poate fi verificată prin electroforeza ARN total pe un gel de agaroză 1%.Această metodă poate configura singur gelul sau poate utiliza sistemul prefabricat E-Gel™ pentru testarea integrității.Mai mult de 80% din ARN total este ARN ribozomal, cea mai mare parte fiind compusă din ARNr 28S și 18S (în sistemele de mamifere).ARN-ul de bună calitate va afișa două bare luminoase evidente, care sunt bare luminoase 28S și, respectiv, 18S, la 5 Kb și 2 Kb, iar raportul va tinde să fie aproape de 2:1.Dacă este într-o stare difuză, înseamnă că proba de ARN poate fi degradată și se recomandă utilizarea metodei descrise mai târziu pentru a testa în continuare calitatea ARN.

Figura 2. Comparația ARN-ului degradat (banda 2) și intact (banda 3) pe electroforeza pe gel de agaroză

03 Bioanalyzer Agilent

Pe lângă metoda de electroforeză pe gel de agaroză descrisă mai sus, care ne poate ajuta să identificăm integritatea ARN-ului simplu și rapid, putem folosi și bioanalizatorul Agilent pentru a determina integritatea ARN-ului.Utilizează o combinație de microfluidic, electroforeză capilară și fluorescență pentru a evalua concentrația și integritatea ARN.Utilizând algoritmul încorporat pentru a analiza profilul probei de ARN, bioanalizatorul Agilent poate calcula o valoare de referință a integrității ARN, ARN Integrity Number (denumit în continuare RIN) [1].Cu cât valoarea RIN este mai mare, cu atât este mai mare integritatea ARN-ului (1 este extrem de degradat, 10 este cel mai complet).Unele experimente care implică ARN sugerează utilizarea RIN ca parametru pentru evaluarea calității.Luând ca exemplu experimentele de secvențiere cu randament ridicat (denumite în continuare NGS), liniile directoare ale Oncomine™ Human Immune Repertoire, care este utilizat pentru detectarea receptorilor de celule B și T din seria de panouri Oncomine de la Thermo Fisher, sugerează că probele cu valori RIN mai mari de 4, pot fi măsurate citiri și clone mai eficiente (Figura 3).Există diferite intervale recomandate pentru diferite panouri și, adesea, un RIN mai mare poate aduce date mai eficiente.

Figura 3, în experimentele Oncomine™ Human Immune Repertoire, probele cu RIN mai mare de 4 pot detecta citiri mai eficiente și clone de celule T.【2】

Cu toate acestea, valoarea RIN are și unele limitări.Deși RIN are o corelație ridicată cu calitatea datelor experimentale NGS, nu este potrivit pentru probele FFPE.Probele FFPE au fost tratate chimic pentru o lungă perioadă de timp, iar ARN-ul extras are în general o valoare RIN relativ scăzută.Cu toate acestea, acest lucru nu înseamnă că datele efective ale experimentului trebuie să fie nesatisfăcătoare.Pentru a evalua cu precizie calitatea probelor FFPE, trebuie să folosim alte măsurători decât RIN.Pe lângă RIN, bioanalyzerul Agilent poate calcula și valoarea DV200 ca parametru de evaluare a calității ARN.DV200 este un parametru care calculează proporția de fragmente mai mari de 200 bp într-o probă de ARN.DV200 este un indicator mai bun al calității probei FFPE decât RIN.Pentru ARN-ul extras de FFPE, are o corelație foarte mare cu numărul de gene care pot fi detectate eficient și diversitatea genelor [3].Deși DV200 poate compensa deficiențele în detectarea calității FFPE, bioanalizatorul Agilent încă nu poate analiza cuprinzător problemele de calitate din probele de ARN, inclusiv dacă există inhibitori în probe.Inhibitorii înșiși pot afecta eficiența de amplificare a experimentelor din aval și pot reduce cantitatea de date utile.Pentru a ști dacă există un inhibitor în probă, putem adopta metoda PCR cantitativă fluorescentă în timp real descrisă în continuare.

04 PCR cantitativ fluorescent în timp real

Metoda PCR cantitativă fluorescentă în timp real poate detecta nu numai inhibitorii din probă, ci și reflecta cu acuratețe calitatea ARN-ului din proba FFPE.În comparație cu analizoarele biologice Agilent, instrumentele cantitative cu fluorescență în timp real sunt mai populare în laboratoarele biologice majore datorită aplicării lor mai largi.Pentru a testa calitatea probelor de ARN, trebuie doar să achiziționăm sau să pregătim sonde de primer pentru genele de referință interne, cum ar fi GUSB (nr. cat. Hs00939627).Folosind acest set de primeri, sonde și standarde (ARN total de concentrație cunoscută) pentru a efectua experimente cantitative absolute, concentrația efectivă a fragmentului de ARN poate fi calculată ca standard de evaluare a calității ARN (cuantificarea ARN funcțională (FRQ) pe scurt).Într-un test NGS, am constatat că FRQ-ul probelor de ARN are o corelație foarte mare cu volumul efectiv de date.Pentru toate probele mai mari de 0,2 ng/uL FRQ, cel puțin 70% din citiri pot acoperi efectiv secvența de referință (Figura 4).

Figura 4, valoarea FRQ detectată prin metoda cantitativă a fluorescenței are o corelație foarte mare (R2>0,9) cu datele efective obținute în experimentul NGS.Linia roșie este valoarea FRQ egală cu 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Pe lângă faptul că este aplicabilă probelor FFPE, metoda PCR cantitativă în timp real poate, de asemenea, monitoriza eficient inhibitorii din probe.Putem adăuga proba care urmează să fie detectată în sistemul de reacție cu Control Intern Pozitiv (IPC) și Analiza acestuia și apoi să efectuăm cuantificarea fluorescenței pentru a obține valoarea Ct.Dacă valoarea Ct rămâne în urma valorii Ct în reacția fără eșantion, aceasta indică faptul că inhibitorul este prezent în probă și inhibă eficiența amplificarii în reacție.

05 Metoda vopselei fluorescente Qubit

Fluorometrul Qubit este cel mai frecvent utilizat dispozitiv mic pentru concentrarea acidului nucleic și detectarea purității, care este ușor de utilizat și există în aproape fiecare laborator de biologie moleculară.Acesta calculează cu precizie concentrația de acid nucleic prin detectarea și colorantul fluorescent care leagă acidul nucleic (reactiv de detectare Qubit).Qubit are sensibilitate și specificitate ridicate și poate cuantifica cu precizie ARN-ul până la concentrația pg/µL.Pe lângă capacitatea binecunoscută de a cuantifica cu exactitate concentrația de acid nucleic, cel mai recent model nou Thermo Fisher, Qubit 4.0, poate detecta și integritatea ARN-ului.Sistemul de detectare a ARN al lui Qubit 4.0 (testul ARN IQ) detectează integritatea ARN prin detectarea simultană a doi coloranți fluorescenți specifici.Acești doi coloranți fluorescenți se pot lega la fragmente mari și, respectiv, la fragmente mici de ARN.Acești doi coloranți fluorescenți indică proporția de fragmente mari de ARN din probă și din aceasta se poate calcula valoarea IQ (Integritate și calitate) reprezentând calitatea ARN.Valoarea IQ este aplicabilă atât probelor FFPE, cât și non-FFPE și are o mare influență asupra calității secvențierii ulterioare.Luând ca exemplu experimentele NGS, în experimentele de testare ARN-Seq efectuate pe platforma Ion torrent™, majoritatea probelor cu valori IQ mai mari de 4 au avut citiri eficiente de cel puțin 50% (Figura 5).În comparație cu metodele de detectare menționate mai sus, testul Qubit IQ nu numai că este mai convenabil de utilizat și durează mai puțin timp (în decurs de cinci minute), dar are și o corelație excelentă între valoarea IQ a parametrului măsurat și calitatea datelor din experimentele din aval.

Figura 5, există o mare corelație între valoarea Qubit ARN IQ și citirile mapate ale ARN-Seq.【5】

Prin introducerea de mai sus, cred că toată lumea are o înțelegere suficientă a diferitelor metode de control al calității ARN.În practică, puteți alegemetoda corespunzătoare în funcție de tipul eșantionului și instrumentele existente.Numai controlând bine calitatea ARN-ului putem evita eșecul experimentelor ulterioare cauzat de calitatea slabă a probei, economisind astfel timp prețios, energie și costuri.

Produse de referinta:

Kit de izolare a ARN total animal

Kit de izolare a ARN total al celulelor

referințe

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: un număr de integritate ARN pentru alocarea valorilor de integritate măsurătorilor ARN.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Ghidul utilizatorului Oncomine Human Imune Repertoire (Pub. Nr. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing ARN Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 170, August Issue, Issue 23192, August 23-19https://doi.org/10.1093/toxsci/