Am fost producător cu experiență.Câștigarea majorității în certificările cruciale ale pieței sale pentru China, cu reduceri mari, Sonda într-un pas de înaltă sensibilitate Rt-QpcrKit V2, Calitatea este viața din fabrică, Concentrarea pe cererea clienților este sursa de supraviețuire și dezvoltare a companiei, Aderăm la onestitate și atitudinea de lucru cu bună-credință, așteptăm cu nerăbdare venirea ta!
Am fost producător cu experiență.Câștigând majoritatea în certificările cruciale ale pieței sale pentruChina Taq ADN polimeraza, Qpcr, Compania noastră promite: prețuri rezonabile, timp scurt de producție și servicii post-vânzare satisfăcătoare, de asemenea, vă așteptăm să vizitați fabrica noastră oricând doriți.Îmi doresc acum să avem o afacere plăcută și pe termen lung împreună!!!

Descrieri

Acest kit folosește un sistem unic de tampon de liză care poate elibera rapid ARN din probele de celule cultivate pentru reacțiile RT-qPCR, eliminând astfel procesul de purificare a ARN laborios și consumator de timp.Șablonul ARN poate fi obținut în doar 7 minute.Reactivii 5×Direct RT Mix și 2×Direct qPCR Mix-SYBR furnizați de kit pot obține rapid și eficient rezultate cantitative PCR în timp real.

5×Direct RT Mix și 2×Direct qPCR Mix-SYBR au o toleranță puternică la inhibitori, iar lizatul probelor poate fi utilizat ca șablon pentru RT-qPCR direct.Acest kit conține transcriptaza inversă Foregene de înaltă afinitate ARN și polimerază Hot D-Taq ADN, dNTPs, MgCl₂, tampon de reacție, optimizator și stabilizator PCR.

Specificații

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Componentele trusei

Caracteristici și avantaje

■ Simplu și eficient: cu tehnologia Cell Direct RT, probele de ARN pot fi obținute în doar 7 minute.

■ Cererea de mostre este mică, pot fi testate până la 10 celule.

■ Debit mare: poate detecta rapid ARN-ul în celulele cultivate în plăci cu 384, 96, 24, 12, 6 godeuri.

■ ADN Eraser poate elimina rapid genomurile eliberate, reduce foarte mult impactul asupra rezultatelor experimentale ulterioare.

■ Sistemul optimizat RT și qPCR face ca transcripția inversă RT-PCR în două etape să fie mai eficientă și PCR mai specifică și mai rezistentă la inhibitorii de reacție RT-qPCR.

Aplicare kit

Domeniul de aplicare: celule cultivate.

- ARN eliberat prin liza probei: aplicabil numai modelului RT-qPCR al acestui kit.

- Trusa poate fi utilizată în următoarele scopuri: analiza expresiei genelor, verificarea efectului de tăcere a genelor mediat de siRNA, screening-ul de medicamente etc.

Diagramă

Depozitare și termen de valabilitate

Partea I a acestui kit trebuie depozitată la 4℃;Partea II trebuie depozitată la -20℃.

Foregene Protease Plus II trebuie păstrat la 4℃, nu înghețați la -20℃.

Reactivul 2×Direct qPCR Mix-SYBR trebuie păstrat la -20℃ în întuneric;dacă este folosit frecvent, poate fi, de asemenea, depozitat la 4℃ pentru depozitare pe termen scurt (utilizare în termen de 10 zile). Suntem producători cu experiență.Câștigarea majorității în certificările cruciale ale pieței sale pentru Reduceri mari China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Calitatea este viața din fabrică, Concentrarea asupra cererii clienților este sursa de supraviețuire și dezvoltare a companiei, Aderăm la onestitate și atitudine de lucru cu bună-credință, așteptând cu nerăbdare venirea ta!
Reduceri mariChina Taq ADN polimeraza, Qpcr, Compania noastră promite: prețuri rezonabile, timp scurt de producție și servicii post-vânzare satisfăcătoare, vă așteptăm, de asemenea, să vizitați fabrica noastră oricând doriți.Îmi doresc acum să avem o afacere plăcută și pe termen lung împreună!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.Nr.DRT-01021/01022

Pentru RT-qPCR direct celular folosind ≤ 1000.000 de celule

Introducerea Produsului

Acest produs folosește un sistem tampon de liză unic pentru a elibera rapid ARN din probele de celule cultivate pentru reacțiile RT-qPCR, eliminând procesul de purificare a ARN laborios și consumator de timp și doar 7 minute pentru a obține șablonul ARN necesar, cu amestecul Direct RT 5×, 2× Direct qPCR Mix-Taqman furnizat de kit poate obține rapid și eficient rezultate PCR în timp real și cantitativ.

5× Direct RT Mix și 2× Direct qPCR Mix-Taqman au o toleranță puternică la inhibitori și pot efectua inversare eficientă și amplificare specifică folosind lizatul probei care urmează să fie măsurat ca șablon.Reactivul conține Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, care poate fi folosit cu tampon de liză pentru a detecta rapid și ușor probele și are caracteristicile de înaltă sensibilitate, specificitate și stabilitate.

Caracteristicile produsului

Tehnologia Cell Direct RT simplă și eficientă, care durează doar 7 minute pentru a obține mostre de ARN.

Cerințele de eșantion sunt mici și un minim de 10 celule cultivate pot fi folosite pentru experimentare.

Debit ridicat pentru achiziția rapidă de ARN a celulelor cultivate, cum ar fi plăcile cu 384, 96, 24, 12 și 6 godeuri.

ADN Eraser este capabil să elimine rapid genomii eliberați, reducând foarte mult impactul asupra rezultatelor experimentale ulterioare.

Sistemele optimizate RT și qPCR permit RT-PCR în două etape cu transcripție inversă mai eficientă, specificitate și toleranță mai puternică la inhibitorul reacției RT-qPCR.

Aplicare kit

Domeniul de aplicare: celule cultivate.

ARN interpretat prin liza probei: utilizat doar ca șablon RT-qPCR în două etape.

Trusele pot fi utilizate în următoarele scopuri: analiza expresiei de reglare a genelor, testarea alelelor, screeningul medicamentelor etc.

Limitări ale trusei

Fragmente amplificate ≤ 300 bp.

Trusele sunt folosite pentru a cultiva celule proaspete.

Controlul calității produsului

Conform sistemului de management al calității totale al FOREGENE, fiecare lot de kituri din seria Cell Direct RT-qPCR este testat riguros de mai multe ori pentru a asigura fiabilitatea și stabilitatea calității fiecărui lot de kituri.

Conținutul trusei

*:Liza celulară, 5×Direct RT Mix, 2×Direct qPCR Mix-Taqman pot fi achiziționate separat; detaliile sunt furnizate în Anexa 1 (PAGINA 13).

Conditii de depozitare

1. Condiții de livrare

Întregul proces de transport al pachetului de gheață la temperatură joasă, pentru a se asigura că setul este în starea <4 °C.

2. Condiții de depozitare

Păstrați partea I la 4°C și partea II la -20°C.

Foregene Protease Plus II trebuie păstrat la 4°C, nu congelat la -20°C.

Reactivul 2× Direct qPCR Mix-Taqman se păstrează la -20°C sau la 4°C pentru utilizare pe termen scurt dacă este utilizat frecvent (în decurs de 10 zile).

Informații despre componentele kit-ului

Tampon CL: Oferă mediul necesar reacțiilor de liză celulară.

Tampon ST: termină substanța activă din lizat pentru a evita efectele asupra RT ulterioară.

ADN Eraser: agent de îndepărtare a ADN-ului, efectul eliminării genomului în experimentele ulterioare.

Mix 5× Direct RT: Conține transcriptază inversă foregenă cu afinitate mare pentru ARN, inhibitor de RNază, dNTP, stabilizatori, amplificatori, optimizatori și primeri de transcripție inversă pentru o aliniere optimă (Primer aleatoriu, Oligo(dT)₁₈Grund).

Foregene Protease Plus II: în contextul tamponului de liză, celulele sunt lizate pentru a elibera acizi nucleici.

2× qPCR direct Mix-Taqman: Acest reactiv conține ADN polimerază D-Taq fierbinte, dNTPs, MgCl₂, tampon de reacție, optimizator PCR și stabilizator.

Colorant de referință 20× ROX: utilizat în general pe instrumentele de amplificare PCR în timp real ale ABI, Stratagene și alte companii, este utilizat pentru a ajusta diferența dintre tuburile și tuburile PCR cauzate de erori de dozare PCR.Concentrația de colorant de referință ROX de 20× necesară pentru diferite instrumente este diferită, iar utilizatorul o poate adăuga în funcție de concentrația recomandată a instrumentului.

DdH fără RNază₂O: Apă ultrapură sterilizată fără RNază pentru reacții RT-qPCR în două etape.

Precauții:(Asigurați-vă că citiți cu atenție măsurile de precauție înainte de a utiliza kitul)

Acordați atenție metodei de operare a experimentului pentru a evita contaminarea încrucișată între probe.

Acordați atenție curățeniei mediului experimental și a ustensilelor pentru a evita contaminarea cu RNază și degradarea ARN.

Luați probe de celule proaspete sau bine conservate și nu utilizați niciodată probe de celule congelate-dezghețate repetate.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ar trebui să evite înghețarea-dezghețarea repetată, altfel va afecta transcrierea inversă și eficiența PCR.

Preparațiiinainte deOperațiune

Asigurați-vă că citiți cu atenție instrucțiunile înainte de a utiliza acest kit.Kitul Cell Direct RT-qPCR este simplu, convenabil și rapid de utilizat, iar instrucțiunile oferă informații complete despre întregul kit și despre modul de utilizare corect.Vă rugăm să pregătiți materialele și echipamentele experimentale necesare înainte de utilizare.

Materiale și echipamente experimentale

◆ Cultură de celule.

◆ 1,5 ml sau 2 ml, tub de centrifugă fără RNază/DNază, vârf fără RNază/DNază, tub qPCR steril de 0,2 ml.

◆ aparat qPCR, pipetă, centrifugă de masă (≥13.400×g) (în funcție de nevoile experimentale), etc.

Siguranță

◆ Acest produs este doar în scopuri de cercetare științifică, vă rugăm să nu-l utilizați în scopuri farmaceutice, clinice, alimentare și cosmetice.

◆ Când utilizați substanțe chimice, purtați haine adecvate de laborator, mănuși, ochelari de protecție etc.

Operațiuneghiduri

Sistemele de liză celulară, sistemele RT și pachetele de suplimente cu soluție de reacție qPCR pot fi achiziționate separat, pentru detalii în Anexa 1 (PAGINA 13).

Ghid de operare

A: Probă de eliberare de ARN

1. Celulele au fost pretratate: se spală placa de cultură celulară cu PBS rece, apoi se lizează celulele (10-10⁶), 10⁶ decât cantitatea de celule, se recomandă Foregene the Cell an ARN Isolation Kit the Total (DE-03111) sau Animal Total ARN Isolation Kit (DE-03011) pentru extracția și purificarea ARN.

1.1.Celule aderente (placă cu 24 de godeuri, de exemplu)

1.1.1.Determinați numărul de celule din fiecare godeu, determinați că numărul de celule este 1 × 10⁵, și folosiți o pipetă pentru a îndepărta mediul de cultură din vasul de cultură.

1.1.2.Adăugați 200 μl de 1 × PBS pre-răcit în fiecare godeu.Nu pipetați în mod repetat și îndepărtați PBS din godeuri.Înclinați placa și îndepărtați cât mai mult PBS posibil.Treceți la pasul 2.

1.1.3.Diferite vase de cultură celulară sau un tabel cu numere de referință 1-1 într-un vas de cultură celulară a fost adăugată prerăcită 1 × PBS pentru spălarea celulelor.

Tabelul 1-1: Dozarea PBS pentru un număr diferit de celule

Notă：Pentru a asigura o aderență fermă a celulelor,un număr mare de pierderi de celule evitate la spălare .

1.2.Celule în suspensie sau celule aderente cultivate în plăci neporoase

1.2.1.Celulele aderente cultivate în plăci non-multi-godeuri (celulele în suspensie încep de la următorul pas 1.2.2), colectează și separă celulele conform metodei normale de colectare a celulelor și plasează-le într-o placă de cultură sau tub de centrifugă;dacă se utilizează tripsinizarea, necesită centrifugare pentru a colecta celulele și pentru a elimina tripsina reziduală, a adăugat celule resuspendate cu PBS în celule individuale pentru a dispersa celulele.

1.2.2.După numărul de celule numărate, celulele alicote 1 x 10⁵ unul pentru a centrifuga tuburile, colectați celulele prin centrifugare la 1000 × g timp de 10 min.

1.2.3.Adăugați 200 μl PBS în tubul de centrifugă, nu pipetați în mod repetat și aspirați direct PBS.treceți la pasul 2. (Dacă este dificil de precipitat și celulele au fost resuspendate din nou, poate fi efectuată 1000 x g centrifugate la 10 minute după eliminarea supernatantului, peletul de celule trece la pasul 2)

2. Liza celulară: Îndepărtați tamponul CL, temperatura sa echilibrată la temperatura camerei, ADN Eraser și Foregene Protease Plus II, conform următorului tabel 1-2, sistemul de liză preparat: (Soluția de liză este gata de utilizare).

Tabelul 1-2: clivaj pregătirea sistemului (Notă: în pregătirea pe gheață)

3. (Placă cu 24 de godeuri, ca exemplu) Se pipetează 200 μl de amestec principal de liză celulară în fiecare godeu, se sufla în mod repetat de 5-10 ori, se incubează la temperatura camerei (20-25 ℃) timp de 5 minute.

Notă：Pentru a evita formarea de bule, atunci când pipeta pipeta scala a fost ajustată la 200μl sau mai puțin.Celulele pot apărea tulburi după liză, ceea ce este normal.

4.(Placa cu 24 godeuri de exemplu) se adaugă în lichid 20 μl Buffer ST (diferite sisteme de liză Buffer ST adăugat într-o cantitate prezentată în Tabelul 1-3), pipetarea repetată de 5-10 ori, la temperatura camerei (20-25 ℃) s-au incubat timp de 2 min.

Notă：Vârful pipetei a fost dispus sub suprafață, asigurându-se că a fost adăugat lizat,pentru a evita formarea de bule, atunci când pipeta pipeta a fost ajustată la 200μl sau mai puțin.

Tabelul 1-3：Adăugați tampon ST

5.Lizatul este utilizat pentru experimentele ulterioare RT-qPCR.Dacă experimentele ulterioare nu pot fi efectuate la timp, vă rugăm să-l păstrați pe gheață timp de cel mult 2 ore și să-l păstrați la -20 ℃ sau -80 ℃ (nu mai mult de trei luni).

B: Pregătirea sistemului RT

1. Scoateți 5 × Direct RT Mix și puneți-l pe o baie de gheață, lăsați-l să se topească în mod natural și amestecați-l ușor pentru utilizare ulterioară;scoateți RNase-Free ddH2O și topiți-l și puneți-l pe o baie de gheață pentru utilizare ulterioară.Pregătiți sistemul de reacție pe gheață conform tabelului 2-1 de mai jos.

Tabelul 2-1: Prepararea sistemului de reacție RT

2. După finalizarea formulării sistemului, amestecați ușor și centrifugați pentru scurt timp în următorul tabel 2 -2 condiții de reacție reacție RT.

Tabelul 2-2: Setarea condiției de reacție RT

3. După terminarea reacției, produsul de reacție a fost plasat direct pe gheață pentru qPCR, vă rugăm să puneți conservarea pe termen lung -20℃ sau -80℃.

Notă: Datorită utilizării șablonului nepurificat, în produsul de transcripție inversă pot apărea precipitate albe.Acesta este un fenomen normal.Se centrifugă imediat supernatantul pentru experimentele ulterioare.

Soluția de reacție RT rezultată este adăugată la următoarele sisteme de reacție PCR în timp real, se recomandă adăugarea unor cantități cuprinse între 10-30% din sistemul de reacție.

C: Pregătirea sistemului de reacție qPCR

1. Cantitatea adecvată de B preparată în etapa șablonului de ADNc conform următorului tabel 3-1 pentru a prepara un sistem de reacție.

Notă: Cantitatea de șablon cADN reprezintă 10-30% din sistemul qPCR.De exemplu, într-un sistem qPCR de 20 μl, adăugați 2-6 μl de tampon de liză, dar nu mai mult de 6 μl.

2. Optimizarea condițiilor bune de qPCR (temperatura de recoacere, etc.) pentru reacția qPCR (condițiile de reacție prezentate în Tabelul 3-2).

Notă: Încercați să utilizați condiții optimizate pentru reacțiile qPCR pentru a obține rezultate mai bune.

Tabelul 3-1: Prepararea sistemului de reacție PCR

1*: Concentrația primerului poate fi ajustată în intervalul 50-900 nM atunci când performanța reacției primerului este slabă.

Notă: Sistemul qPCR poate fi ajustat în funcție de nevoile experimentale și modelul de ciclor de fluorescență.Pentru qPCR într-un 50μl, ajustați doza de reactiv proporțional conform 20μl sistem.

2*: Selectați concentrația finală adecvată de colorant de referință ROX în funcție de termociclorul cantitativ cu fluorescență.Cele mai potrivite concentrații de colorant de referință ROX pentru cicloarele cantitative cu fluorescență obișnuite sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Tabelul 3-2: Sunt furnizate condițiile de reacție qPCR

Notă: Pentru a obține cel mai bun efect qPCR, gradient PCR poate fi utilizat pentru a optimiza condițiile de reacție pentru diferite șabloane și diferiți primeri.Condițiile de reacție PCR variază în funcție de analizor de fluorescență, șablon, primer etc. În operațiunea specifică, condițiile optime de reacție trebuie proiectate în funcție de condițiile specifice ale termociclorului cantitativ cu fluorescență, tipul șablonului, dimensiunea fragmentului de interes, secvența de baze a fragmentului amplificat și conținutul GC și lungimea primerilor, inclusiv temperatura de recoacere, timpul de reacție etc.

Principii de proiectare a primerului PCR în timp real

Grund direct și Grund invers

Pentru PCR în timp real, designul primerului este foarte important.Primerii sunt legați de specificitatea și eficiența amplificării prin PCR și pot fi proiectați cu referire la următoarele principii:

◆ Lungimea grundului: 18-30bp.

◆ Conținut GC: 40-60%.

◆ Valoarea Tm: Software-ul de proiectare a grundului, cum ar fi Primer 5, poate da valoarea Tm a grundului.Valorile Tm ale primerilor din amonte și din aval ar trebui să fie cât mai apropiate posibil.Se poate folosi și formula de calcul Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Când se efectuează PCR, o temperatură sub valoarea amorsului Tm de 5 °C este în general selectată ca temperatură de recoacere (creșterea corespunzătoare a temperaturii de recoacere poate crește specificitatea reacției PCR).

◆ Primeri și produse PCR:

◆ Lungimea produsului de amplificare PCR a primerului de proiectare este de preferință 100-150 bp.

◆ Amorsele de proiectare din zona structurală secundară a șablonului trebuie evitate pe cât posibil.

◆ Evitați formarea a 2 sau mai multe baze complementare între capetele 3′ ale primerilor din amonte și din aval.

◆ Primer 3′ baza terminală nu poate fi prezentă cu 3 G sau C consecutive suplimentare.

◆ Primerii în sine nu pot avea structuri complementare, altfel se va forma o structură în ac de păr, care afectează amplificarea PCR.

◆ ATCG trebuie distribuit cât mai uniform posibil în secvența primerului, iar baza terminală 3′ ar trebui evitată ca T.

Apendice1：Cell DirectRT-qPCR Componenta kitt pachet de suplimente

1. Soluție de liză celulară