Escherichia Coli O157: Kit de detectare a acidului nucleic H7 (Metoda cu sondă fluorescentă PCR/Liofilizare)
Descriere kit:
Cat.Nr.FP103
Este utilizat pentru detectarea și screeningul rapid de E. coli O157:H7 în alimente, furaje, probe de apă și probe de mediu.
Descrieri
Este folosit pentrudetectarea rapidă și screening-ul E. coli O157:H7 în alimente, furaje, probe de apă și probe de mediu.
[Principiul de testare]
Conform principiului tehnologiei fluorescente PCR, primeri specifici și sonde Taqman sunt proiectate pentru gena specifică a Escherichia coli O157: H7 și detectate de un instrument PCR fluorescent, astfel încât să realizeze detectarea Escherichia coli O157: H7 Detectarea calitativă a ADN-ului.
Conținutul setului
Notă: Sonda canalului ROX nu este inclusă.
| Coponenţi | Specificație | Qentitate |
| tampon A | Tub | 1 |
| tampon B | Tub | 1 |
| Control pozitiv | Tub | 1 |
| Control negativ | Tub | 1 |
Utilizare așteptată
Este folosit pentru detectarea rapidă și screening-ul E. coli O157:H7 în alimente, furaje, probe de apă și probe de mediu.
Condiții de depozitare și data de expirare
Depozitați la -20℃ în întuneric și evitați înghețarea și dezghețarea repetată.
Perioada de valabilitate este 12luni, iar data producției este afișată pe ambalajul exterior.
Instrumente și consumabile
Instrument PCR cantitativ fluorescent, pistol cu pipetă și vârfuri potrivite, agitator vortex, mini centrifugă.
Utilizare
1. Prelucrarea probelor
1.1 Tipul de eșantion: Acest kit este potrivit pentru alimente, furaje, probe de apă și alte probe suspectate a fi contaminate cu Escherichia coli O157:H7.Pentru produsele din carne procesate în profunzime, băuturi și alte substanțe care conțin pigmenți, acestea trebuie clătite pentru a evita afectarea colectării semnalului de fluorescență.
1.2 Prelucrarea probelor: Consultați „GB 4789.10-2016 Standardul național pentru siguranța alimentelor Examinarea microbiologică a alimentelor Escherichia coli O157: Test H7” pentru prepararea probei, cultura de îmbogățire și izolarea Escherichia coli O157: H7.
- Nextracția acidului ucleic
Luați 20 ml de soluție de îmbogățire într-un tub de centrifugă de 1,5 ml, adăugați 200 μL de lizat microbian (este necesar un kit suplimentar), agitați timp de 30 de secunde, centrifugeți scurt și lăsați deoparte.
Observații: Extracția acidului nucleic din lizat ar trebui să fie finalizată în decurs de 10 minute și nu poate fi păstrată pentru o perioadă lungă de timp.
3. Amplificarea acidului nucleic
3.1 Porniți instrumentul de PCR cantitativ fluorescent pentru utilizare.
Tamponul A și tamponul B din trusă, topește-le bine și centrifugă pentru scurt timp.Adăugați 18 μL tampon A și 2 μL tampon B în fiecare tub de reacție PCR.Apoi adăugați câte 5 ml de control negativ, acid nucleic extras și control pozitiv în tuburile de reacție PCR, acoperiți tuburile și centrifugați scurt.
3.3 Transferați tubul de reacție PCR într-o mașină PCR fluorescentă și utilizați următoarele proceduri pentru a efectua experimente de amplificare: selectați 25 ml pentru sistemul de reacție, colectați semnale de fluorescență la 60°C pentru fiecare ciclu și selectați FAM pentru canalul de detecție.
| Etapa | Program | Numărul de cicluri |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (colectați fluorescența) |
Ghiduri pentru analiza problemelor
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Niciun ARN nu poate fi extras sau randamentul de acid nucleic este scăzut
De obicei, există mulți factori care afectează eficiența recuperării, cum ar fi: conținutul de ARN al probei, metoda de operare, volumul de eluție etc..
Analiza cauzelor comune:
1. Baie de gheață sau centrifugare la temperatură joasă (4 ° C) în timpul funcționării.
Sugestie: Funcționare la temperatura camerei (15-25 ° C), niciodată baie cu gheață și centrifugă la temperatură joasă.
2. Depozitarea incorectă a probei sau depozitarea probelor pentru prea mult timp.
Sugestie: Păstrați probele la -80 ° C sau congelați în azot lichid și evitați utilizarea repetată a înghețului-dezghețului;încercați să utilizați probe proaspăt colectate pentru extracția ARN.
3.Liza insuficientă a probei
Recomandare: Vă rugăm să vă asigurați că proba și soluția de lucru (acrilamidă liniară) au fost bine amestecate și incubate timp de 10 minute la temperatura camerei (15-25 ° C)
4. Eluentul a fost adăugat incorect
Recomandare: Asigurați-vă că ddH2O fără RNază este adăugat la mijlocul membranei coloanei de purificare
5. Volum necorespunzător de etanol anhidru în tampon viRW2
Sugestie: Urmați instrucțiunile, adăugați volumul corect de etanol anhidru în Buffer viRW2 și amestecați-le bine înainte de a utiliza kitul.
6.Utilizarea necorespunzătoare a probei.
Sugestie: 200 µl de probă la 500 µl de tampon viRL.Volumul excesiv de probă va duce la o viteză redusă de extracție a ARN.
7.Volum de eluție necorespunzător sau eluție incompletă.
Sugestie: Volumul de eluant al coloanei de purificare este de 30-50μl;dacă efectul de eluție nu este satisfăcător, se recomandă adăugarea ddH fără RNază preîncălzită2O și prelungește timpul de plasare la temperatura camerei, cum ar fi 5-10 min
8. Coloana de purificare are reziduuri de etanol după clătirea în tampon viRW2.
Sugestie: Dacă etanolul rămâne încă după clătirea în tampon viRW2 și centrifugarea cu tub gol timp de 2 minute, coloana de purificare poate fi lăsată la temperatura camerei timp de 5 minute după centrifugarea tubului gol pentru a îndepărta complet etanolul rămas.
Degradarea moleculelor de ARN purificate
Calitatea ARN-ului purificat este legată de factori precum depozitarea probei, contaminarea cu RNază și funcționarea.
Analiza cauzelor comune:
1. Probele colectate nu au fost salvate la timp.
Sugestie: Dacă proba nu este utilizată la timp după colectare, vă rugăm să o păstrați la -80 ℃ sau azot lichid imediat.Pentru extragerea moleculelor de ARN, încercați să utilizați probe proaspăt colectate ori de câte ori este posibil.
2. Probele colectate au fost înghețate și dezghețate în mod repetat.
Sugestie: Evitați înghețarea și decongelarea repetată (nu mai mult de o dată) în timpul colectării și depozitării probei, altfel randamentul de acid nucleic va scădea.
3.RNaza a fost introdusă în sala de operație sau nu s-au purtat mănuși de unică folosință, măști etc.
Sugestie: Experimentul de extracție a moleculelor de ARN se efectuează cel mai bine într-o cameră separată de operație ARN, iar masa experimentală este curățată înainte de experiment.Purtați mănuși și măști de unică folosință în timpul experimentului pentru a evita degradarea ARN cauzată de introducerea RNazei.
4. Reactivul este contaminat cu RNază în timpul utilizării.
Sugestie: Înlocuiți cu noul kit de izolare a ARN viral pentru experimente conexe.
5.Contaminarea cu RNază a tuburilor de centrifugă, vârfurilor pipetei etc. Sugestie: Asigurați-vă că tuburile de centrifugă, vârfurile pipetei și pipetele nu conțin RNază.
Moleculele de ARN purificate au afectat experimentele din aval
Moleculele de ARN purificate de coloana de purificare vor afecta experimentele din aval dacă există prea mulți ioni de sare sau proteine, cum ar fi: transcripție inversă, Northern Blot etc.。
1. Există ioni de sare rămași în moleculele de ARN eluate.
Recomandare: Asigurați-vă că a fost adăugat volumul corect de etanol anhidru în Buffer viRW2 și spălați coloana de purificare de două ori în conformitate cu viteza de centrifugare corectă din instrucțiunile de operare; Dacă mai rămân ioni de sare, puteți adăuga Buffer viRW2 în coloana de purificare și lăsați-l la temperatura camerei timp de 5 minute.Apoi efectuați centrifugarea pentru a elimina în cea mai mare măsură contaminarea cu ioni de sare
2. Există etanol rămas în moleculele de ARN eluate
Sugestie: odată ce ați confirmat că coloanele de purificare au fost clătite cu Buffer viRW2, efectuați centrifugarea cu tub gol conform turației centrifugei din instrucțiunile de operare.Dacă mai rămâne etanol, acesta poate fi lăsat timp de 5 minute la temperatura camerei după o centrifugare cu tub gol pentru a îndepărta etanolul rămas în cea mai mare măsură.
Manuale de instructiuni:
Manual de instrucțiuni kit de izolare a ARN viral
