1. Detectați absorbanța soluției de ARN
Absorbanța la 280, 320, 230 și 260 nm reprezintă valorile acidului nucleic, fondului (turbiditatea soluției), concentrația de sare și respectiv materie organică, cum ar fi proteina.În general, uitați-vă doar la OD260/OD280 (Ratio, R).Când 1,8 ~ 2,0, credem că contaminarea proteinelor sau a altor materii organice în ARN poate fi tolerată, dar trebuie remarcat că atunci când Tris este utilizat ca tampon pentru detectarea absorbanței, valoarea R poate fi mai mare de 2 (în general ar trebui să fie <2,2).Când R<1,8, poluarea proteinelor sau a altor materii organice din soluție este mai evidentă, iar soarta ARN-ului poate fi determinată în funcție de nevoi.Când R>2,2, înseamnă că ARN-ul a fost hidrolizat într-un singur acid nucleic.
2. Modelul electroforetic al ARN-ului
În general, gelul denaturant este utilizat pentru electroforeza ARN, dar dacă este doar pentru detectarea calității ARN, gelul denaturant nu este necesar și poate fi utilizat gelul de agaroză obișnuit.Scopul electroforezei este de a detecta integritatea benzilor 28S și 18S și raportul acestora sau integritatea frotiului de ARNm.În general, dacă benzile 28S și 18S sunt luminoase, clare și ascuțite (referindu-ne la marginile benzilor sunt clare), iar luminozitatea lui 28S este mai mult de două ori mai mare decât a benzii 18S, considerăm că calitatea ARN-ului este bună.
Cele de mai sus sunt cele două metode pe care le folosim în mod obișnuit, dar niciuna dintre aceste două metode nu ne poate spune clar dacă există RNază reziduală în soluția de ARN.Dacă există o cantitate foarte mică de RNază în soluție, este dificil pentru noi să o detectăm cu metoda de mai sus, dar majoritatea reacțiilor enzimatice ulterioare sunt efectuate la peste 37 de grade și pentru o perioadă lungă de timp.În acest fel, dacă există o cantitate foarte mică de RNază în soluția de ARN, atunci va exista un mediu și un timp foarte potrivit pentru a-și juca rolul în experimentele ulterioare și, desigur, experimentul va fi rece în acest moment.Mai jos introducem o metodă care poate confirma dacă există RNază reziduală în soluția de ARN.
3. Test de conservare a căldurii
În funcție de concentrația probei, extrageți două 1000 ng ARN din soluția de ARN și adăugați-l într-un tub de centrifugă de 0,5 ml și completați-l cu tampon Tris pH 7,0 până la un volum total de 10 ul, apoi sigilați capacul tubului.Pune unul dintre ele într-o baie de apă cu temperatură constantă la 70°C și ține-l cald timp de 1 oră.Cealaltă parte a fost păstrată la -20°C timp de 1 oră.Când timpul expiră, scoateți cele două probe pentru electroforeză.După ce electroforeza este finalizată, comparați benzile electroforetice ale celor două.Dacă benzile celor două sunt consistente sau nu au nicio diferență semnificativă (desigur, benzile lor îndeplinesc și condițiile din metoda 2), înseamnă că nu există contaminare reziduală cu RNază în soluția de ARN, iar calitatea ARN-ului este foarte bună.Dimpotrivă, dacă proba incubată la 70°C prezintă o degradare evidentă, aceasta indică faptul că există contaminare cu RNază în soluția de ARN.
2 Metode și tehnici experimentale pentru extracția ARN
Problemele pe care le întâlnim adesea la extragerea ARN-ului sunt: (1) randamentul ARN este scăzut;(2) ARN-ul are o poluare gravă cu sare;(3) ARN-ul are o poluare gravă cu solvenți organici;(4) degradarea probei și alte probleme
1. Reactivi de extracție a ARN total utilizați în mod obișnuit
Metoda izotiocianat de guanidină și metoda Trizol sunt cele mai utilizate metode pentru extracția ARN total din țesuturile animale și celulele animale.Este potrivit în special pentru mostre mici și țesuturi care sunt deosebit de dificil de extras, cum ar fi extracția ARN total din pielea de iepure și țesutul conjunctiv animal;în plus, Trizolul, ca reactiv de liză de uz general, poate fi utilizat și pentru extracția țesuturilor plantelor, bacteriilor, ciupercilor și a altor țesuturi.Pentru țesuturile vegetale care conțin polizaharide și polifenoli, cum ar fi camelia oleifera, frunze de ceai, rapiță etc., metoda CTAB poate fi utilizată și pentru extragerea ARN total.
Ca metodă convențională, metoda cu dublă coloană este, de asemenea, foarte populară datorită funcționării sale la temperatură normală, nu este nevoie să adăugați RNază și siguranța - fără cloroform, fenoli și alți reactivi organici pentru extracție.(Produse Recomandate )
2. Extragerea ARN total din tesuturile animale
(1) Încercați să alegeți țesut proaspăt, dacă nu este proaspăt (de preferință în decurs de trei luni - frigider 80 ℃ sau congelat în azot lichid. Când tăiați țesut, nu tăiați direct la temperatura camerei, asigurați-vă că puneți-l pe cutia de gheață, încercați să evitați înghețarea și dezghețarea repetată.
(2) Folosiți foarfece și pensete curate pentru a tăia o bucată mică de țesut, încercați să tăiați partea centrală a țesutului atunci când tăiați proba sau mai întâi tăiați bucata mare de țesut de la mijloc și apoi tăiați proba în poziția de incizie proaspătă.Țesutul îndepărtat trebuie mărunțit complet, pune țesutul mărunțit într-un tub EP fără RNază, se adaugă lizat, țesutul mărunțit trebuie să fie complet expus la lizat și se pregătește pentru omogenizare.
(3) Pentru țesuturi normale, selectați țesuturi de mărimea unui fasole mung (30-60 mg) pentru omogenizare.Dacă țesuturile conțin o cantitate mare de proteine, grăsimi sau țesuturi fibroase dense, cum ar fi ficatul, creșteți sau reduceți în mod corespunzător cantitatea de țesuturi tăiate (opțional) Alegeți 10~20 mg).
(4) Dacă se extrag mușchi de pește, carne de creveți, meduze și alte țesuturi cu conținut ridicat de apă, volumul probei trebuie crescut în mod corespunzător (recomandat 100-200 mg).
(5) Dacă condițiile permit, țesutul animal poate fi extras direct după omogenizare cu un omogenizator de țesuturi cu trecere înaltă, dacă nu există un astfel de echipament.
(6) ARN-ul obținut după extracția finală trebuie plasat imediat pe cutia de gheață pentru a reduce degradarea ARN-ului.
3. Extracția ARN celulelor animale
(1) Celulele în suspensie: se centrifug direct și se aruncă mediul, se spală cu PBS steril de 1-2 ori, apoi se suspendă cu o cantitate adecvată de PBS și apoi se adaugă lizat pentru liză.Nu adăugați lizat direct în celulele precipitate după ce ați aruncat complet lichidul.Acest lucru va face ca pachetul de histonă eliberat după celulele lizate de pe stratul exterior să adere la exteriorul celulelor precipitate, limitând astfel contactul celulelor din interiorul peletei cu lizatul., rezultând în liză celulară incompletă și randament redus de ARN.
(2) Celulele care sunt semi-aderente sau care nu sunt strâns aderente: După aruncarea mediului, spălați cu PBS de 1-2 ori, apoi absorbiți direct o cantitate adecvată de PBS și suflați vasul de cultură cu o pipetă sau un pistol pentru a elimina celulele și transferați-le în celulele fără ARN.Adăugați lizat în tubul EP al enzimei pentru extracție.
(3) Celulele aderente: trebuie mai întâi digerate cu tripsină, apoi colectate în tuburi EP fără RNază, centrifugate pentru a îndepărta supernatantul, spălate de 1-2 ori cu PBS pentru a îndepărta excesul de tripsină și resuspendate cu o cantitate adecvată de PBS Apoi treceți la etapa de extracție.
4. Extracția ARN din plante
Țesuturile plantelor sunt bogate în compuși fenolici sau bogate în polizaharide sau conțin niște metaboliți secundari neidentificați sau au activitate ridicată a RNazei.Aceste substanțe sunt strâns combinate cu ARN după liza celulară pentru a forma complexe insolubile sau precipitate coloidale, care sunt greu de îndepărtat.Prin urmare, atunci când extragem țesut vegetal, trebuie să alegem un kit pentru plante.Lizatul din kit poate rezolva eficient problemele oxidării ușoare a polifenolilor și separării compușilor polizaharidici și acizilor nucleici.
(Pentru extracția ARN-ului din plante polizaharide polifenoli, produse recomandate:
(1) Coaja, pulpa, semințele, frunzele etc. ale plantei trebuie măcinate complet într-un mojar.În timpul procesului de măcinare, azotul lichid trebuie completat la timp pentru a evita topirea probei.Proba măcinată trebuie adăugată rapid la lizat și agitată pentru a evita degradarea ARN.
(2) Pentru mostrele bogate în fibre, cum ar fi orezul și frunzele de grâu, cantitatea de extracție trebuie redusă în mod corespunzător, altfel măcinarea și liza țesuturilor nu vor fi complete, rezultând un randament scăzut de ARN extras.
(3) Pentru țesuturile vegetale cu conținut ridicat de apă, cum ar fi fructele de rodie, fructele de pepene verde, fructele de piersici etc., dimensiunea eșantionului trebuie mărită în mod corespunzător (100-200 mg este opțional).
(4) Țesuturile vegetale, cum ar fi frunzele plantelor, rizomii, fructele dure și alte materiale, se recomandă, în general, să folosească azot lichid pentru a mortar complet ingredientele într-un mortar și apoi să treacă la etapa de extracție.Omogenizatorii convenționali de țesut pot să nu fie eficienți în omogenizarea țesuturilor vegetale și, în general, nu sunt recomandați.
5. Precauții pentru extracția ARN
(1) Probele de țesut trebuie să fie cât mai proaspete posibil pentru a evita înghețarea și dezghețarea repetată.
(2) Țesutul trebuie să fie complet măcinat în timpul extracției, iar cantitatea de țesut nu trebuie să fie prea mică, darămite prea mare.
(3) După adăugarea lizatului, trebuie acordat un timp de incubare suficient pentru a liza complet proba.
(4) Când se utilizează metoda Trizol pentru extracție, principiul absorbției supernatantului după stratificare este „prefer să inhalați mai puțin decât să inhalați mai mult”, și nu trebuie să extrageți în stratul mijlociu, altfel va provoca o contaminare gravă a ADN-ului genomic.
(5) La spălare, lichidul de spălare ar trebui să se infiltreze complet în jurul peretelui tubului pentru a asigura o spălare completă.
(6) Pentru metoda de extracție a coloanei, pe lângă detașarea coloanei după spălare, coloana de adsorbție trebuie de asemenea plasată într-un banc ultra-curat și suflată timp de 5-10 minute pentru a evapora complet solventul organic până la uscare.
(7) La ultima eluare a metodei coloanei, după adăugarea apei DEPC, aceasta trebuie incubată timp de 3-5 minute sau apa DEPC trebuie încălzită la 60°C în avans pentru a crește randamentul de eluție.În metoda tradițională de scindare cu Trizol și precipitare cu izopropanol, ARN-ul final este dizolvat în apă DEPC, așa că trebuie acordat un timp adecvat pentru dizolvare, iar fundul tubului de centrifugă trebuie suflat continuu cu un vârf de pipetă.
3 Taici Cauze și soluții pentru concentrația scăzută de ARN/calitate slabă
1. Randamentul este prea mic
Proba extrasă este prea mică, cantitatea totală este insuficientă sau proba extrasă este prea mare și liza nu este completă;țesutul sau celulele de calitate corespunzătoare trebuie utilizate pentru extracție, pretratarea probei trebuie făcută bine, iar liza trebuie să fie suficientă.
2. Reziduuri de genom
La extragerea prin metoda Trizol, când supernatantul este aspirat în stratul mijlociu după stratificare, se va produce o contaminare gravă a genomului;trebuie avută o atenție suplimentară la stratificare pentru a evita aspirarea în stratul mijlociu.Dacă pentru extracție se folosește metoda coloanei, se poate selecta pentru extracție un kit care conține DNază I.Acidul nucleic adsorbit pe membrană este digerat direct cu DNaza I, care poate reduce foarte mult reziduurile de ADN.
3. degradarea ARN
Poate fi degradarea probei extrase în sine sau degradarea cauzată în timpul procesului de extracție;pe cât posibil, probele proaspete trebuie utilizate pentru extragerea ARN-ului, iar probele colectate trebuie păstrate la timp în azot lichid sau la frigider -80°C și trebuie evitate înghețarea și decongelarea repetată.În procesul de extracție a ARN trebuie utilizate vârfuri fără RNază/DNază, tuburi de centrifugă și alte materiale.Procesul de extracție ar trebui să fie cât mai rapid posibil.ARN-ul extras trebuie plasat pe o cutie de gheață și depozitat la -80 în timp.Dacă ARN-ul extras trebuie detectat prin electroforeză pe gel, electroforeza trebuie efectuată imediat după extracție, iar tamponul de electroforeză trebuie înlocuit cu unul nou preparat.
4. Reziduuri de sare și solvenți organici
Reactivii de extracție conțin săruri de fenol și guanidină, iar soluția de spălare conține etanol.În timpul procesului de extracție, lizatul nu a fost complet absorbit și aruncat, iar soluția de spălare nu a fost complet uscată.Sărurile reziduale și solvenții organici sunt dăunători pentru transcrierea inversă și PCR ulterioară.Grade diferite de inhibare, astfel încât lizatul de țesut ar trebui să fie complet îndepărtat în timpul procesului de extracție, iar spălarea ar trebui să fie suficientă, astfel încât pereții din jur ai tubului să poată fi spălați.În plus, tubul este golit și suflat este un pas necesar, care va reduce și mai mult reziduul de materie organică.
Pentru mai multe informații despre extracția ARN, vă rugăm să urmați site-ul nostru web:
www.foreivd.com pentru mai multe informații.
Ora postării: 01-12-2022
